燈盞乙素酰胺類衍生物的合成及抗白血病活性研究

柳丙玲，秦雪瑩，曲 藝，韓 通

(黑龍江八一農墾大學 制藥工程系，黑龍江 大慶 163319)

燈盞乙素，是從菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz的干燥全草中分離得到的一種黃酮苷類化合物[1]。現代藥理研究表明，燈盞乙素具有心血管保護活性、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[2]。臨床上常作為主要有效成分，用于治療心血管類疾病。近年來，燈盞乙素的抗腫瘤功能的研究與開發日益受到重視。研究發現，燈盞乙素可以通過多種途徑來發揮抗癌作用。主要包括，燈盞乙素可以誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤轉移和侵襲、逆轉腫瘤細胞的耐藥性和增加腫瘤對藥物的敏感性等[3-6]。此外，燈盞乙素的藥理毒理實驗表明，燈盞乙素即使較高的給藥劑量下，對動物的毒性也較低[7]。進一步表明燈盞乙素具有較好的選擇性。但燈盞乙素的結構不穩定，體內易代謝，生物利用度低的問題，限制其進一步的開發[8]?？蒲腥藛T嘗試在其羧基部位成酯，獲得了多種燈盞乙素酯類衍生物，發現這些衍生物的藥代性質得到了一定的改善，但仍不是很穩定[9-10]。為了進一步提高燈盞乙素的穩定性和抗腫瘤活性，本研究擬合成燈盞乙素的酰胺類衍生物，選取多種脂肪胺，進行縮合，成酰胺鍵。此外，甲氧基是黃酮類天然產物中較為常見的活性基團，很多含有甲氧基的黃酮類化合物均具有較好的生物活性，因此，我們引入甲基于燈盞乙素的4'-OH和6-OH處。，綜上，本研究合成了燈盞乙素酰胺類衍生物，并選取對燈盞乙素較為敏感的人白血病細胞株HL-60和THP-1，測試了目標化合物的體外抗增殖活性測試。

1 結果與討論

1.1 合成及結構解析

本文以市售的燈盞乙素為原料，經三步化學反應，合成目標化合物4a-d。首先，以碘甲烷為甲基化試劑，于燈盞乙素結構中的4'-OH、6-OH和糖羧基位置上甲基，得到甲基化燈盞乙素中間體2。進一步經醇鈉水解，脫去糖羧基上的甲基保護基，得到羧基裸露的中間體3。選取多種脂肪胺，包括丙胺、異丙胺、己胺和環己胺，在縮合劑HOBt和EDCI的條件下，與中間體3室溫反應，得到目標化合物4a-d。并通過1H-NMR和HR-MS對目標化合物的結構進行確證。以化合物4a的波譜數據為例，進行分析。在1H-NMR譜中，δ12.92單峰為結構中5-OH信號；δ8.08和7.13附近出現雙峰且耦合常數相同，歸屬為結構中B環的2'，6'和3'，5'的信號氫；δ7.04和6.97為單峰，分別歸屬為結構中A環8位和C環的3位上信號氫；δ5.52、5.22、5.15和3.91，表現為寬單峰或雙峰，為糖上的醇羥基和糖上脂肪烴氫信號；4'和6位甲氧基的信號也很明顯，分別為δ3.87和3.77的單峰；丙胺的兩個亞甲基的信號為δ3.04和1.41附近的多重峰，甲基在δ0.79處顯示三重峰。在高分辨質譜中，HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741，found 554.1650，表明分子量正確。綜上，可以確認目標化合物結構的正確性。

1.2 衍生物4a-d的抗白血病細胞株增殖活性

選取人白血病細胞株HL-60和THP-1，采用臺盼藍染色法測試了目標化合物4a-d的體外抗腫瘤細胞株增殖活性，具體結果見表1。表中數據結果表明，燈盞乙素酰胺衍生物4a-d，對兩株細胞株都具有抗增殖活性?；衔?b-d對THP-1的IC50值明顯低于燈盞乙素；4b和4d對HL-60的抑制能力與燈盞乙素相當；化合物4a對兩株細胞株的抑制活性均與燈盞乙素相差不大。其中化合物4c對兩株細胞株的抑制能力最強，其IC50分別為4.21和5.76μM，表現出較強的抗腫瘤活性。

表1 目標化合物4a-d體外抗白血病細胞 株HL-60和THP-1增殖活性

2 結論

本文共合成了四個結構全新的燈盞乙素酰胺類衍生物4a-d，并采用臺盼藍染色法，對所合成的目標化合物進行體外抗白血病細胞株活性測試。實驗結果表明燈盞乙素酰胺衍生物對HL-60和THP-1細胞株都具有一定的抗增殖作用。部分化合物對THP-1細胞株的抑制能力強于先導化合物燈盞乙素。其中化合物4c對兩株細胞的抑制作用最強，并明顯強于燈盞乙素。以上結果，為燈盞乙素的進一步抗腫瘤研究奠定基礎。

3 實驗部分

3.1 儀器與試劑

實驗儀器：Bruker-ARX-300型和Bruker-AV-600型(TMS作內標)核磁共振光譜儀。日本島津GCMS-5050A氣質聯用儀；Agilent 1100離子阱型液-質聯用儀。

實驗材料：燈盞乙素(純度98%，南京澤朗生物科技有限公司)；柱色譜分離采用硅膠H或硅膠(200～300目)，薄層色譜用硅膠GF254，均采購于青島海洋化工廠；其他試劑與化學原料均為化學純或分析純。

3.2 實驗方法

3.2.1 中間體2的合成

取燈盞乙素(1.39g，3mmol)，溶于DMF(10mL)中，加入碘甲烷(1.12mL，18mmol)和DBU(2.3mL，15mmol)，室溫攪拌，反應24 h后終止反應。將反應液傾入100 mL冰水混合物中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，飽和食鹽水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，經硅膠柱色譜分離，得淡黃色固體635mg，收率41.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.96 (s,1H,5-OH),8.03 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.55 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.48 (d,2H,J = 7.4 Hz,Ar-H),7.36 (m,9H,Ar-H),7.25 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.20 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.12 (s,1H,H-8),6.95 (s,1H,H-3),5.66 (d,1H,J=5.3 Hz,H-1),5.57 (d,1H,J = 5.7 Hz,sugar hydroxyl),5.43 (d,1H,J=7.4 Hz,sugar hydroxyl),5.37 (d,1H,J = 5.3 Hz,sugar hydroxyl),5.24 (s,2H,-CH2-),5.17(d,2H,J = 11.9Hz,-CH2-),5.02 (d,2H,J = 10.9 Hz,-CH2-),4.29 (d,1H,J = 9.6 Hz,H-5 ),3.53-3.40 (m,3H,H2,3,4);MS(ESI) m/z733.2[M+H]+。

3.2.2 中間體3的合成

取化合物2(504mg，1mmol)，溶于二氯甲烷/醇溶液中(32mL),滴加甲醇鈉(2～3mL)，室溫反應8-12h。濃縮，加入水(10mL)，調pH值至3-5，抽濾，烘干，得黃色固體461mg，收率94.1%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm):12.94 (s,1H,5-OH),8.06 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.15 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.09 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.61 (s,1H,H-1 ),5.50 (s,1H,sugar hydroxyl),5.37 (s,1H,sugar hydroxyl),5.33 (d,1H,J = 7.0 Hz,sugar hydroxyl),4.21 (d,1H,J = 9.4 Hz,H-5 ),3.87 (s,3H,-OCH3),3.76 (s,3H,-OCH3),3.66 (s,3H,-OCH3),3.48-3.35 (m,3H,H-2 ,3 ,4 );MS(ESI) m/z: 491.1[M+H]+。

3.2.3 目標化合物4a-d的合成

取中間體3(60mg，0.12mmol)，HOBt(20mg，0.14mmol)，EDCI(46 mg，0.24mmol)溶于DMF中(2mL)，攪拌至完全溶解。加入相對應的脂肪胺(0.14mmol)，室溫避光反應2h。將反應液傾入20mL冰水混合物中，用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，經硅膠柱分離，得到燈盞乙素酰胺類衍生物4a-d。

目標化合物4a，黃色粉末，收率61.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.92 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),8.01 (t,1H,J = 5.6 Hz,-NH-),7.13 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.04 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.22 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.5 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5),3.87 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.42 (m,3H,H-2,3,4 ),3.04 (m,2H,-CH2-),1.41 (m,2H,-CH2-),0.79 (t,3H,J = 7.4 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1650。

目標化合物4b，黃色粉末，產率49%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.09 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),7.94 (m,1H,-NH-),7.12 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.05 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.24 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.10 (d,1H,J = 7.6 Hz,sugar hydroxyl),3.87 (s,3H,-OCH3),3.82 (d,1H,J = 7.1 Hz,H-5 ),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52 (m,1H,-CH-),3.39-3.37 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.08 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3),1.03 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1652。

目標化合物4c，黃色粉末，產率36%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-2 ,6 ),8.00 (s,1H,-NH-),7.11 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-3 ,5 ),7.03 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.54 (d,1H,J = 5.4 Hz,H-1 ),5.25 (d,1H,J = 5.1 Hz,sugar hydroxyl),5.22 (d,1H,J = 5.0 Hz,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.3 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.37 (m,3H,H-2,3,4),3.06 (m,2H,-CH2),1.36-1.05 (m,8H,-CH2-),0.66 (t,3H,J = 6.7 Hz,-CH3);HRMS (ESI) m/z calcd for C29H35NO11[M+Na]+596.2210,found 596.2195。

目標化合物4d，黃色粉末，產率13%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.90 (s,1H,5-OH),8.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.98 (d,1H,J = 8.5 Hz,-NH-),7.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.08 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.53 (s,1H,H-1 ),5.25 (s,2H,sugar hydroxyl),5.08 (d,1H,J = 7.4 Hz,sugar hydroxyl),3.88 (s,1H,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.55-3.41 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.73-1.22 (m,11H,-CH2-,-CH3); HRMS (ESI) m/z calcd for C29H33NO11[M+Na]+594.2054,found 594.2123。

3.3 體外抗白血病細胞增殖實驗

采用臺盼藍法測試目標化合物4a-d的抗腫瘤活性。選取人白血病細胞株HL-60和THP-1在37 C、5%CO2飽和濕度的培養箱中常規培養。培養液為含10%熱滅活胎牛血清，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的RPMI1640細胞培養基。48h更換培養液，細胞貼壁后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗用細胞均處于對數生長期，臺盼藍拒染法表明細胞活力大于95%。

取對數生長期的受試細胞，以5×104cells/mL的密度接種于24孔板內，每孔內2mL。接種完畢后即加入相應濃度的待測藥物。藥物處理72h后，從每孔的細胞懸液中吸取50μL細胞懸液，加入50μL的0.4%臺盼藍溶液中混勻，在3min內，于光學顯微鏡下觀察，分別計數每孔的細胞總數。每孔中的總細胞數占對照孔總細胞數的百分比即為該濃度藥物的生長抑制率。