番茄紅素合成基因組合優化和產物測定

周親親，徐沙，周景文*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

番茄紅素是一種抗氧化活性較強的天然色素，其單態氧淬滅速率是β-胡蘿卜素的2倍[1]，能有效清除自由基，延緩細胞衰老，對預防前列腺癌、肺癌及心血管疾病等有顯著作用[2-3]，被廣泛應用于食品添加劑、保健食品與化妝品等行業。目前因植物提取法存在提取率低、純度低等問題、化學合成法存在手性基團無法控制、得率低等缺點，番茄紅素的工業生產受到一定限制。而目前天然微生物合成法在發酵過程中為了阻斷從番茄紅素到β-胡蘿卜素的合成反應，需要添加阻斷劑，導致番茄紅素產量和純度較低[4]。隨著合成生物學和代謝工程的發展，改造模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母構建高效細胞工廠已經引起廣泛關注[5-7]。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S.cerevisiae)是公認為安全無毒(generally recognized as safe,GRAS)的真核模式微生物，已成功被改造用于生產青蒿酸[8]、次丹參醌[9]、白藜蘆醇[10]以及人參皂苷[11]等多種天然產物。相對大腸桿菌，釀酒酵母具有真核表達系統的翻譯后修飾且不含內毒素，以其作為宿主細胞生產番茄紅素具有較大競爭力。釀酒酵母本身存在萜類化合物合成的通用途徑即甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway, MVA pathway)[12]，萜類化合物構成的基本單元為異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。這2個基本單元在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)依次催化下，得到番茄紅素合成前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)。八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,CrtB)將2分子GGPP縮合成八氫番茄紅素(phytoene)，在外源八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene denydrogenase，CrtI)作用下連續四步脫氫分別合成六氫番茄紅素(phytofluene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、鏈孢霉素(neurosporene)和最終產物番茄紅素[13]。

本研究所選擇的宿主釀酒酵母中，只需外源表達CrtE、CrtB和CrtI就能得到目標產物番茄紅素。然而這3個酶來源分布廣泛，包括噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)等細菌、三孢布拉氏霉菌等真菌、番茄、西瓜等植物和藻類。不同物種來源的酶的催化活性往往有很大差異[14-16]，因此篩選不同來源的路徑基因進行組合，根據產量確定最佳組合，提高番茄紅素合成途徑通量可能是有效的手段。另一方面，由于目前文獻報道的番茄紅素的檢測方法分析時間長、不易定量[17]、需要價格昂貴的標準品[18]等缺點，需要建立一種適用于實驗室范圍的快速穩定的測定方法。綜上，本研究首先分別在乙醇脫氫酶系(adh2、adh3、adh4)基因位點整合3個拷貝數的不同來源CrtE基因強化GGPP供給，構建不同來源CrtB、CrtI的組合游離表達質粒，轉化上述GGPP供給強化的突變株，然后篩選番茄紅素合成基因組合，同時建立了一種酶標儀快速測定番茄紅素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

菌株：大腸感受態EscherichiacoliJM109(E.coliJM109)、釀酒酵母宿主菌YPH499△gal80，實驗室保藏。

質粒：pMD19-T載體，用于TA克隆,Takara公司；酵母表達載體pY26-GPD-TEF、大腸表達載體pET28(a)+、酵母CRISPR-Cas9編輯系統質粒302、149、BTS、Cas9載體，實驗室保藏。

1.1.2 工具酶、試劑及培養基

Taq mix DNA聚合酶，BIO SCI寶賽生物公司；DNA連接酶，Takara公司；限制性內切酶(BamH I、BglII、EcoR I、NcoI、NheI、NotI)，Thermo Scientific公司；質粒小提試劑盒、DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Axygen公司；氨芐青霉素，上海生工生物工程有限公司；G418、潮霉素(hygromycin B，Hyg)、番茄紅素標準品，上海源葉生物有限公司；硫酸諾爾斯菌素(nourseothricin，Nour)，上海愍康生物科技有限公司；天然β-胡蘿卜素標準品，麥克林；甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷、二氯甲烷、石油醚、2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene,BHT)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷,用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測，阿拉丁aladdin；玻璃珠(0.5 mm)，Sigma Aldrich公司。

培養基：LB培養基(酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，固體培養基添加20 g/L瓊脂粉)用于大腸桿菌的培養；YPD培養基(酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、無水葡萄糖20 g/L，固體培養基添加20 g/L瓊脂粉)用于釀酒酵母的培養。

1.1.3 儀器與設備

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、小型臺式高速離心機,Eppendorf公司；凝膠成像儀,BIO-RAD公司；UV-3200分光光度計,MAPADA公司；SPARK多功能酶標儀,Tecan公司；高效液相色譜儀-示差檢測器,Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同來源CrtE、CrtB、CrtI基因的異源表達

本研究合成異源基因查詢NCBI數據庫，根據宿主菌釀酒酵母進行密碼子優化后由金唯智(蘇州)公司合成保存在pUC57質粒上(命名為pUC57-CrtE、pUC57-CrtB、pUC57-CrtI)。本研究所用到的菌株、基因和引物如表1～表3所示。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this work

表2 本研究所用的基因Table 2 Gens used in this work

1.2.2 質粒構建

番茄紅素表達質粒構建：首先以pY26-GPD-TEF質粒為模板，用引物PY26-F、PY26-R反向擴增，NcoI/NheI雙酶切后純化得pY26載體片段；同時以含kan基因質粒pET28(a)+為模板，用引物Kan-F、Kan-R擴增，NcoI/NheI雙酶切后純化得kan基因，將二者所得產物16 ℃連接6 h后轉化E.coliJM109，菌落PCR驗證正確后測序確認。然后將質粒醋酸鋰轉化釀酒酵母YPH499△gal80，涂布于YPD(添加500 mg/L G418)平板上30 ℃倒置培養，2～3 d后平板上長出轉化子表明kan抗性基因的功能性存在，成功將原始pY26-GPD-TEF質粒的篩選標記替換為KanMX，命名為pY26-kan，作為番茄紅素合成基因表達的骨架質粒。接著BglII/NotI雙酶切pUC57-CrtI、pY26-kan質粒后，純化產物并16 ℃連接6 h后轉化E.coliJM109，菌落PCR驗證正確后測序確認(pY26-CrtI)。最后BamH I/EcoR I雙酶切pUC57-CrtB、pY26-CrtI質粒后，純化產物并連接轉化E.coliJM109，菌落PCR驗證后測序確認，構建pY26-McCrtB-BtCrtI等16個不同組合的番茄紅素表達質粒(表4)。

表3 本研究所用到的引物Table 3 Primers used in this work

續表3

表4 本研究所用的質粒Table 4 Plasmids used in this work

模塊整合質粒構建：以pUC57-AtCrtE為模板，擴增出兩端帶有adh2 up(adh2基因起始密碼子上游50 bp)和adh2 down(adh2 基因終止密碼子下游50 bp)的片段連接pMD19-T，命名為Module1；其他模塊類似方法構建并命名。

釀酒酵母CRISPR-Cas9編輯系統質粒構建：以302質粒為模板，用gRNA302bp-F/gRNA302bp(ADH2)-R引物擴增得到302 bp片段；同時以149質粒為模板gRNA149bp(ADH2)-F/gRNA149bp-R引物擴增得到149 bp片段；再以302 bp和149 bp片段為模板，用gRNA302bp-F/gRNA149bp-R融合PCR得到472 bp片段后BamH I/BcuI雙酶切純化；sgRNA骨架質粒BTSBamH I/BcuI雙酶切純化，將2個純化產物連接轉化E.coliJM109。菌落PCR驗證正確后測序確認，命名為gRNA-ADH2。并用相同方法構建adh3、adh4位點sgRNA質粒。

1.2.3 模塊整合基因組和轉化子篩選

在上述3個GGPP強化供給的工程菌中分別轉入16個不同組合的番茄紅素游離表達質粒，在YPD-G418平板上30 ℃恒溫倒置培養2～3 d，直至長出單菌落，根據顏色鑒別篩選出顏色較深的工程菌。

1.2.4 搖瓶發酵

將篩選到的工程菌接種到添加500 mg/L YPD液體培養基中30 ℃，220 r/min搖瓶培養24 h制備種子液，檢測OD600。以最終OD600=0.5轉接至含50 mL YPD液體培養基(添加500 mg/L G418)的三角瓶中，30 ℃，220 r/min搖瓶培養72 h檢測中間過程生長OD600、細胞干重及最終產物含量。

1.2.5 番茄紅素快速檢測方法的探究

不同溶劑中番茄紅素和β-胡蘿卜素的吸收圖譜：取10個小燒杯，分別稱取5份1 mg番茄紅素標準品和5份1 mg β-胡蘿卜素標準品，加入小燒杯中，分別用甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷、含2%(體積分數)二氯甲烷的石油醚溶解倒入25 mL的容量瓶中，定容后配成不同溶劑下的番茄紅素標準溶液和β-胡蘿卜素標準溶液。用分光光度計在400～600 nm范圍內掃描吸收值。

正己烷中番茄紅素標準曲線的制作：稱取番茄紅素標準品1.25 mg，加入燒杯中用正己烷溶解后倒入25 mL容量瓶中，定容后配制成質量濃度為50 mg/L 的標準品溶液，分別稀釋成0.01、0.02、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40和45 mg/L不同濃度的稀釋液。以正己烷作為空白對照，分別吸取200 μL至96孔酶標板，在最大吸收波長472 nm處測定吸光值。每個濃度樣品重復3個平行樣，室溫測得吸光值后制作標準曲線，并確定檢測限。

1.2.6 番茄紅素提取與檢測

加大監管力度，規范生產經營行為。濮陽市局扎實推進執法監管“一制兩化”（即落實監管責任制，推進執法監管規范化、法治化），實行網格化、痕跡化監管，著力提升執法監管水平。注重加強行刑銜接，成立了行刑銜接工作領導小組，健全了聯席會議、案件備案回復和案件復查等工作機制。

胞內番茄紅素含量的檢測：取6管發酵液，每管取收集1.5 mL發酵液于12 000 r/min離心3 min，無菌水清洗后，加適量體積的玻璃珠和1 mL提取液(含10 g/L BHT的丙酮)，振蕩破碎3 min，冰浴1 min，重復5次，12 000 r/min離心10 min，取上清液；再加入1 mL提取液提取后將6管所得的上清液合并；上清液用液氮吹干后，用正己烷溶解并用0.22 μm有機膜過濾，用酶標儀檢測OD472。

HPLC檢測：以Waters Xbridge BEH C18為色譜柱(150 mm×2.1 mm 3 μm)，V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=21∶21∶8為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長472 nm。

2 結果與分析

2.1 強化前體供應工程菌的構建和生產番茄紅素釀酒酵母細胞的初篩

本研究分別選取不同物種(植物、真菌、細菌)來源的3種CrtE、4種CrtB和4種CrtI進行密碼子優化，來源包括模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana, At)、曼地亞紅豆杉、番茄(Solanumlycopersicum, Sl)、葫蘆科苦瓜屬的木鱉果(Momordicacochinchinensis, Mc)、苦瓜(Momordicacharantiasubsp.Charantia, Mc)、成團泛菌、三孢布拉氏霉菌、紅法夫酵母。用CRISPR-Cas9的方法分別在宿主菌YPH499△gal80中乙醇脫氫酶系的adh2、adh3、adh4基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF)整合3個拷貝數的AtCrtE、PaCrtE和TmCrtE，陽性克隆經過特異性引物驗證后(圖1)，得到前體強化菌499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE。菌落PCR驗證引物JP-ADH2F、JP-ADH3F、JP-ADH4F分別在adh2、adh3、adh4基因位點上游300 bp左右，JP-AR、JP-PR、JP-TR在整合基因AtCrtE、PaCrtE和TmCrtE300 bp左右。

雙基因表達質粒pY26-kan的基礎上，將McCrtB、PaCrtB、SlCrtB、XdCrtB、BtCrtI、McCrtI、SlCrtI和XdCrtI進行組合得到16個番茄紅素表達質粒(表4)，分別轉入499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE這3株強化GGPP供應的重組菌中，轉化后涂布G418平板，形成48株重組菌，結果如圖2所示。通過觀察顏色發現，相比較宿主菌YPH499△gal80，有9株菌有顏色(AtE-PaB-BtI、PaE-PaB-BtI、PaE-McB-BtI、PaE-XdB-BtI、PaE-XdB-XdI、TmE-PaB-BtI、TmE-PaB-XdI、TmE-XdB-BtI和TmE-XdB-XdI)，其余菌均為白色，其中499-3TmCrtE轉入pY26-PaCrtB-BtCrtI質粒的重組菌(命名為TmE-PaB-BtI)顏色較深,最終篩選得到1株最優組合的菌株，即TmCrtE、PaCrtB、BtCrtI。

CrtE所編碼的GGPPS是番茄紅素合成路徑中的關鍵限速酶，由圖2-b、2-c、2-g可知，當轉入相同質粒pY26-PaCrtB-BtCrt時，含TmCrtE菌株顏色最深，含PaCrtE菌株次之，含AtCrtE菌株顏色最淺。由圖2-c和2-d可知，木鱉果McCrtB和三孢布拉霉氏菌來源BtCrtI組合后菌體呈淺黃色，而成團泛菌PaCrtB和BtCrtI組合后菌體呈淺黃色但較前者深，因此木鱉果來源McCrtB在釀酒酵母中表達并不是一個好的選擇。由圖2-g～2-j可知，PaB-BtI、XdB-BtI、XdB-XdI 3個組合的菌顏色都較深。

a-工程菌499-3AtCrtE;b-工程菌499-3PaCrtE;c-工程菌499-3TmCrtE圖1 工程菌499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE的PCR驗證Fig.1 PCR verification of strains 499-3AtCrtE, 499-3PaCrtE and 499-3TmCrtE注：a圖中， M為DNA分子量標準；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產物；泳道4，5，6為499-3AtCrtE的PCR產物。引物JP-ADH2F/JP-AR用于驗證AtCrtE基因在adh2位點的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-AR用于驗證AtCrtE基因在adh3位點的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-AR用于驗證AtCrtE基因在adh4位點的整合(泳道3和6)。b圖中， M為DNA分子量標準；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產物；泳道4，5，6為499-3PaCrtE的PCR產物。引物JP-ADH2F/JP-PR用于驗證PaCrtE基因在adh2位點的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-PR用于驗證PaCrtE基因在adh3位點的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-PR用于驗證PaCrtE基因在adh4位點的整合(泳道3和6)。c圖中，M為DNA分子量標準；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產物；泳道4，5，6為499-3TmCrtE的PCR產物。引物JP-ADH2F/JP-TR用于驗證TmCrtE基因在adh2位點的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-TR用于驗證TmCrtE基因在adh3位點的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-TR用于驗證TmCrtE基因在adh4位點的整合(泳道3和6)

a-YPH499△gal80;b-AtE-PaB-BtI：499-3AtCrtE轉入質粒pY26-PaCrtB-BtCrtI;c-PaE-PaB-BtI：499-3PaCrtE轉入質粒pY26-PaCrtB-BtCrtI;d-PaE-McB-BtI：499-3PaCrtE轉入質粒pY26-McCrtB-BtCrtI;e-PaE-XdB-BtI：499-3PaCrtE轉入質粒pY26-XdCrtB-BtCrtI;f-PaE-XdB-XdI：499-3PaCrtE轉入質粒pY26-XdCrtB-XdCrtI；g- TmE-PaB-BtI：499-3TmCrtE轉入質粒pY26-PaCrtB-BtCrtI；h-TmE-PaB-XdI：499-3TmCrtE轉入質粒pY26-PaCrtB-XdCrtI;i-TmE-XdB-BtI：499-3TmCrtE轉入質粒pY26-XdCrtB-BtCrtI;j-TmE-XdB-XdI：499-3TmCrtE轉入質粒pY26-XdCrtB-XdCrtI圖2 釀酒酵母番茄紅素重組菌初篩Fig.2 Preliminary screening of S.cerevisiae lycopene production recombinant strains

2.2 番茄紅素和β-胡蘿卜素在不同溶劑中的吸收圖譜

番茄紅素和β-胡蘿卜素由于獨特的分子結構(共軛雙鍵)，在可見光范圍內均有吸收。番茄紅素是一種多不飽和脂肪烴，極性較低，基本不溶于水，在多元醇(乙醇、甘油、丙二醇)中難溶，易溶于油脂溶劑中。番茄紅素和β-胡蘿卜素在甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷及含2%(體積分數)二氯甲烷的石油醚不同溶劑中的吸收圖譜如圖3所示。

由圖3可知，番茄紅素在5種不同的溶劑中的吸收情況和吸收峰不相同。在三氯甲烷和石油醚中的番茄紅素在400～600 nm有3個明顯的吸收峰，位置分別在450、475、510 nm左右。在甲苯中番茄紅素在450～515 nm吸收較強；在丙酮中，番茄紅素在420～475 nm吸收較強，吸收峰在450 nm處；在正己烷中，番茄紅素在440 nm處有吸收峰，在430～495 nm吸收較強。β-胡蘿卜素在5種不同溶劑中吸收情況和吸收峰類似。溶解于5種不同溶劑中的β-胡蘿卜素在420～485 nm吸收較強，且吸收峰有1～2個，其中在440～465 nm均有1個吸收峰，而在甲苯中430 nm處還有1個吸收峰。

從β-胡蘿卜素對番茄紅素的檢測干擾程度來看，甲苯作為溶劑時番茄紅素吸收較強(450～500 nm)，此時β-胡蘿卜素的吸收也較強，對檢測干擾較大；三氯甲烷作為溶劑時在番茄紅素最大吸收峰472 nm處β-胡蘿卜素的吸收值高于番茄紅素，對檢測有較大干擾；正己烷作為溶劑時番茄紅素在472 nm處有較強吸收，而β-胡蘿卜素的吸收較低。丙酮和石油醚都有一定毒性，因此選擇正己烷作為檢測溶劑，并根據番茄紅素在正己烷中的吸收圖譜，選擇472 nm為測定波長。

目前文獻報道的番茄紅素的檢測方法主要有紫外分光光度法[19]、高效液相色譜法[20]、薄層色譜法[17]。液相色譜法存在程序復雜、檢測時間長，薄層色譜法存在耗時長、不易定量等問題。然而酶標儀的測定仍然是基于紫外分光光度法，根據文獻[19]報道，由于β-胡蘿卜素分子和番茄紅素分子結構均為長鏈多雙鍵的脂肪烴，檢測時β-胡蘿卜素對番茄紅素的干擾始終無法避免，但對于快速高通量檢測番茄紅素的產量是一種較為有效的手段。

a-甲苯;b-三氯甲烷;c-丙酮;d-正己烷;e-石油醚圖3 番茄紅素和β-胡蘿卜素在不同溶劑中的吸收圖譜Fig.3 Absorption spectrum of lycopene and beta-carotene in different solvent

2.3 番茄紅素在正己烷中標準曲線的制作和檢測范圍的確定

在472 nm處測定一系列不同濃度的番茄紅素標準液，以吸光值對番茄紅素的質量濃度作圖，得到不同濃度的番茄紅素在正己烷中的吸收值(圖4-a)。由圖4-b 可知，番茄紅素在低質量濃度0.05～12 mg/L時，吸光值和番茄紅素的質量濃度成線性關系；質量濃度高于20 mg/L時，吸光值隨番茄紅素質量濃度的升高而增大，但沒有良好的線性關系。以正己烷為溶劑測得的回歸方程Y=0.070 3X+0.008 2(R2=0.997 2)。質量濃度在0.5～12 mg/L，線性關系良好，準確度高，可用來計算番茄紅素產量。由圖4-c可知，番茄紅素標準品溶液質量濃度為0.01～0.5 mg/L時，吸收值沒有良好的線性關系，因此最低檢出限為0.5 mg/L。

a-0.01～50 mg/L番茄紅素在正己烷中的吸收;b-番茄紅素在正己烷中的標準曲線;c-低質量濃度番茄紅素在正己烷中的吸收圖4 不同質量濃度的番茄紅素在正己烷中的吸收Fig.4 Absorbance of lycopene with different concentrations in hexane

2.4 番茄紅素搖瓶發酵測定

為了進一步驗證初篩的9株重組菌顏色鑒別結果，選擇YPD基本培養基作為發酵培養基，搖瓶發酵72 h后破碎細胞，最終產量用酶標儀檢測。由于搖瓶發酵規模和重組菌產量較低的限制，為了篩選生產性能最優的重組菌，僅在發酵結束時測定最終產量。從圖5可知，最高產量的重組菌TmE-PaB-BtI最終產量為1.33 mg/g DCW，表明來源于曼地亞紅豆杉的TmCrtE、成團泛菌的PaCrtB和三孢布拉霉氏菌的BtCrtI組合，可強化番茄紅素生產能力。對比僅轉入pY26-PaCrtB-BtCrtI質粒的對照菌499-PaB-BtI，當整合3個拷貝數的AtCrtE后，AtE-PaB-BtI發酵72 h時產量為0.22 mg/g DCW，提高了2倍；當整合3個拷貝數的PaCrtE后，PaE-PaB-BtI最終產量為0.35 mg/g DCW，提高了3.6倍；當整合3個拷貝數的TmCrtE后，TmE-PaB-BtI最終產量提高了16.5倍。結果表明當整合3個拷貝數的CrtE，提高了宿主菌中GGPP的積累，對番茄紅素產物的積累有利，而且曼地亞紅豆杉來源的TmCrtE比其他來源的CrtE對增加產物的積累更加有效。

由圖6可知，工程菌的生長速度比宿主菌YPH499△gal80慢，最終生物量均有所降低。10株工程菌中，PaE-PaB-BtI生長速度最為緩慢，最終生物量降僅為宿主菌的21.5%(圖6-b)；PaE-XdB-BtI和TmE-PaB-XdI這2株菌生長相對較好，但最終生物量僅為宿主菌的43.9%和45.3%(圖6-b、圖6-c)；與僅轉入pY26-PaCrtB-BtCrtI質粒的對照菌499-PaB-BtI相比，整合表達3個拷貝數CrtE后對生長有一定影響，最終生物量降低33.2%～48.6%(圖6-d)。

圖5 釀酒酵母重組菌番茄紅素產量Fig.5 Lycopene production of recombinant S.cerevisiae strains

a-AtE-PaB-BtI生長曲線;b- PaE-PaB-BtI、PaE-McB-BtI、PaE-XdB-BtI、PaE-XdB-XdI生長曲線;c- TmE-PaB-BtI、TmE-PaB-XdI、TmE-XdB-BtI、TmE-XdB-XdI生長曲線;d- 499-PaB-BtI、AtE-PaB-BtI、PaE-PaB-BtI、TmE-PaB-BtI生長曲線圖6 釀酒酵母重組菌生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant S.cerevisiae strains

2.5 發酵產物HPLC驗證

對篩選最佳組合TmE-PaB-BtI的產物進行HPLC驗證，結果如圖7所示，產物和標準品在相同時間范圍內有多個出峰。

3 討論

隨著合成生物學和代謝工程的發展，研究人員針對宿主細胞和目的產物生物合成途徑進行目的性改造，在生產具有重要經濟價值和藥用價值的化合物(萜類、黃酮類等)具有十分廣闊的應用前景。目前已有很多文獻報道了構建高效細胞工廠合成番茄紅素的策略。KIM等[21]引入成團泛菌來源的CrtE、CrtB、和CrtI，過表達dxs和idi提高MEP通量，并引入異源強化的MVA途徑從而強化IPP和DMAPP供給，最終產量達到1.35 g/L。陳艷[22]敲除GAL誘導系統，并敲除遠端遺傳位點ypl062w后通過對番茄紅素合成路徑中異源基因來源(CrtE、CrtB、和CrtI)的組合篩選，獲得強化番茄紅素生產能力的較優組合，利用啟動子強度和整合拷貝數對關鍵限速酶BtCrtI進行微調，將番茄紅素產量提高到40.64 mg/g DCW。

a-500 mg/L番茄紅素標準品；b-TmE-PaB-BtI發酵產物圖7 番茄紅素和發酵產物HPLC分析Fig.7 HPLC analysis of lycopene and fermentation product

GGPP是釀酒酵母中番茄紅素合成途徑的關鍵前體物質[23]，提高其供給能提高番茄紅素合成的通量。代謝工程中利用多基因重組技術對細胞代謝途徑進行定向改造，構建高效的合成途徑生產番茄紅素。不同物種來源的基因所編碼的酶的催化性能往往具有顯著差異，因此篩選不同物種來源的途徑基因(CrtE、CrtB、和CrtI)進行組合優化是提高合成途徑通量的有效手段。

文獻報道曼地亞紅豆杉來源的TmCrtE比其他來源的CrtE的底物(FPP)結合口袋更大，對FPP的親和性更高[16]，因此轉入表達質粒后顏色較深。木鱉果來源McCrtB和三孢布拉霉氏菌來源BtCrtI組合后菌體呈淺黃色，而成團泛菌來源PaCrtB和BtCrtI組合后菌體呈黃色但較前者深，因此木鱉果來源McCrtB在釀酒酵母中表達并不是一個好的選擇。作為蝦青素生產菌的紅法夫酵母能合成番茄紅素，而文獻已闡明CrtYB是一個雙功能酶，包括八氫番茄紅素合酶功能域和β-胡蘿卜素環化酶功能域2個部分，因此當異源表達XdCrtB時，菌體合成的一部分番茄紅素會被異構成β-胡蘿卜素，最終產物不純，因此最終篩選得到1株最優組合的菌株，即TmCrtE、PaCrtB、BtCrtI，搖瓶發酵最終產量為1.33 mg/g DCW，為進一步獲得高產番茄紅素細胞工廠提供基礎。然而本研究發酵篩選時僅僅測定發酵結束時的產量，由于搖瓶發酵規模的限制和重組菌產量較低的問題，過程中間產量并未測定。同時為了快速高通量檢測番茄紅素的含量，本研究優化了傳統的分光光度法，用丙酮振蕩提取細胞破碎混合物，再用正己烷溶解番茄紅素并用酶標儀檢測。這種檢測方法始終基于紫外分光光度法，產物中β-胡蘿卜素對番茄紅素的干擾始終是消除的，為快速檢測和高通量檢測提供了思路。