EDTA抗凝血對(duì)四種試驗(yàn)結(jié)果的影響

黃穩(wěn)妃 李春英 覃明強(qiáng) 謝華艷 黃永梅/廣西欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 535000

當(dāng)前生豬生產(chǎn)受非洲豬瘟的影響、飼料價(jià)格上漲及環(huán)保升級(jí)的嚴(yán)峻考驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)形勢(shì)和動(dòng)物防疫管理工作需要，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)《關(guān)于加強(qiáng)動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估做好跨省調(diào)運(yùn)種豬產(chǎn)地檢疫有關(guān)工作的通知》要求嚴(yán)格開展動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，評(píng)估內(nèi)容包括區(qū)域動(dòng)物疫病流行病學(xué)調(diào)查情況、種豬場防疫條件、養(yǎng)殖檔案記錄、有關(guān)疫病日常檢測情況等。使用抗凝管采血可最大限度分離血清也能保證血清清澈透明，通過使用含乙二胺四乙酸（EDTA）鹽的抗凝血清對(duì)三種不同動(dòng)物疫病相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果與正常析出血清進(jìn)行對(duì)比分析，討論結(jié)果差異原因、提高檢測準(zhǔn)確率、避免誤診，對(duì)豬場疫病監(jiān)測和凈化有具體實(shí)用的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

純水儀、單道、多道移液器、生化培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、量筒、試管、離心機(jī)。

1.2 血清樣品

A組：豬血液樣品30份，自然分離析出血清，編號(hào)備用。

B組：同一份含乙二胺四乙酸鹽（EDTA）的抗凝豬血液樣品30份，分離血漿，編號(hào)備用，編號(hào)順序同非抗凝血樣品。

1.3 診斷試劑口蹄疫O型液相阻斷ELISA檢測試劑盒購于中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所診斷中心，批號(hào)：20200401101-1；

豬高致病性藍(lán)耳病間接ELISA檢測試劑盒購于韓國金諾生物公司，批號(hào)：20200203；

布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原購于青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，批號(hào)：010011905，010013201。

1.4 檢測原理及方法豬O型口蹄疫抗體檢測依據(jù)《口蹄疫診斷技術(shù)-液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作》（GB/T 18935-2018）進(jìn)行。液相阻斷ELISA檢測方法是使用雙抗體夾心法，針對(duì)抗原分子兩個(gè)不同決定簇單克隆抗體分別作為固相抗體、酶標(biāo)抗體，ELISA在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的新型免疫測定方法，過程包括抗體（抗原）吸附在固定載體上這一過程稱為包被，分別按順序加待檢抗原（抗體），酶標(biāo)記抗體（抗原），形成抗體（抗原）加待檢抗體（抗原）加酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，再加入酶底物發(fā)生有色反應(yīng)，最后通過酶標(biāo)儀在特定波長的光波下吸收計(jì)算抗體（抗原）的量值。

O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。病毒抗原對(duì)照4孔，棄去最高最低OD值，計(jì)算剩余2孔OD值的平均值，即為臨界值。待檢樣品OD值＞臨界值，判定為陰性；待檢樣品OD值≦臨界值，判定為陽性，陽性最高稀釋倍數(shù)為樣品效價(jià)，抗體效價(jià)大于或等于1:64為O型口蹄疫抗體陽性，1:32～1:64為可疑，小于1:32為陰性。

豬高致病性藍(lán)耳病抗體檢測依據(jù)《豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)》（GB/T18090-2008）進(jìn)行操作。間接ELISA檢測方法是已知定量抗原包被在固定載體上，依次加入等檢抗體與之結(jié)合（第一抗體），加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（第二抗體）與第一抗體結(jié)合形成抗原-抗體-酶標(biāo)第二抗體復(fù)合物，加入酶底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后通過酶標(biāo)儀在特定波長的光波下吸收計(jì)算抗體（抗原）的量值。

豬高致病性藍(lán)耳病間接ELISA。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。樣品S/P值=（樣品OD值-陰性O(shè)D均值） /（陽性O(shè)D均值-陰性O(shè)D均值），S/P值≧0.4為陽性，S/P值＜0.4為陰性。

布魯氏菌病抗體檢測依據(jù)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）進(jìn)行。試管凝集試驗(yàn)（SAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)是布魯氏菌病檢測、診斷的2種檢驗(yàn)方法，在實(shí)際操作過程中，RBPT作為快速初篩，陽性樣品再次用SAT定性確定。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果表明，采自同一頭豬的血液樣品，經(jīng)使用含EDTA分離血清和自然分離析出血清分別檢測，EDTA對(duì)O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA，豬高致病性藍(lán)耳病抗體間接ELISA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯的差異（詳見表1）。ELISA是抗原抗體特異性結(jié)合酶標(biāo)物反應(yīng)顯色試驗(yàn)，特異性明顯，與抗體效價(jià)對(duì)應(yīng)關(guān)系穩(wěn)定，通過儀器設(shè)備判讀結(jié)果，操作步驟雖繁多，但受客觀及理化因素影響較小。

含EDTA分離血清對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)存在較大的差異（詳見表1、2），結(jié)果顯示含抗凝劑EDTA的血漿樣品虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，試管凝集試驗(yàn)為陰性；而和同一份豬血液樣品自然析出血清試管凝集試驗(yàn)為陰性。根據(jù)實(shí)際檢測過程中，虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)作為快速初篩，陽性樣品再次用試管凝集試驗(yàn)（SAT）定性確定，可以判定含EDTA抗凝劑的樣品在虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)中會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性凝集現(xiàn)象，顯假陽性，從而影響結(jié)果判定造成誤診。

表1 不同血清樣品檢測結(jié)果（+表示陽性，-表示陰性）

表2 不同血清對(duì)四種試驗(yàn)結(jié)果差異情況