恩諾沙星殘留酶聯免疫分析法的建立

穆洪濤， 李嘉慧， 劉鳳銀， 黃玉琦

（廣東第二師范學院 生物與食品工程學院， 廣東 廣州510303）

0 引言

喹諾酮類抗生素具有抗菌譜范圍廣、殺菌活性高及毒副作用較小的特點，對水生、陸生動物的疾病預防與治療有良好的效果，因此被廣泛應用于獸醫臨床中［1］. 市場調研顯示，畜禽類產品中存在檢出喹諾酮類藥物超標的現象［2－5］，殘留的藥物被人體攝入后會產生不良作用［6－9］，因此開發快速簡便的喹諾酮類藥物檢測方法勢在必行. 目前檢測喹諾酮類藥物的方法主要有高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、酶聯免疫分析法、膠體金免疫層析法等［10－16］. 色譜法雖然靈敏度高，重復性強，準確性強，但對檢測樣品的處理要求較高，對儀器依賴強，不適于大批樣品的快速篩查；免疫法具有操作簡單、特異性強、快速靈敏等特點，且樣品前處理方法簡單，適用于大批量樣品的快速檢測. 因此本研究選擇恩諾沙星、達氟沙星、沙拉沙星3 種藥物為研究對象，通過制備高效的免疫原免疫動物獲得抗恩諾沙星抗體，開發檢測恩諾沙星的酶聯免疫分析法.

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 主要試劑與材料

鹽酸恩諾沙星（≥98.0%）、甲磺酸達氟沙星（≥98.0%）、鹽酸沙拉沙星（≥98.0%）、氧氟沙星（≥98.0%）、環丙沙星（≥98.0%）、諾氟沙星（≥98.0%）、氟甲喹（≥98.0%）、噁喹酸（≥98.0%）、牛血清白蛋白（BSA，99%）、卵清白蛋白（OVA，99%）、1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，99%）、3，3′，5，5′－四甲基聯苯胺（TMB，99%）、過氧化脲等，廣州齊云生物技術有限公司提供； BALB／c 雌性小鼠（3 周）和新西蘭雌性白兔（2 kg），廣東省醫學實驗動物中心提供； 其他試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

SP－Max2300A 光吸收型全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）、RT－3100 全自動洗板機（深圳雷杜生命科學股份有限公司）、DK－8AD 電熱恒溫水熱槽（上海一恒科學儀器有限公司）、XP.5002 電子天平（上海越平科學儀器有限公司）、MX－F 震蕩儀（SCILOGEX）、PHSI－5 實驗室pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）.

1.2 人工抗原的合成與鑒定

用紫外分光光度法測0.5 mg·mL－1ENR－BSA、ENR－OVA 在200 ～800 nm 進行全波長掃描，根據其峰值判斷人工抗原的偶聯情況.

1.3 動物免疫及血清評價

1.3.1 BALB／c 雌性小鼠免疫

本研究先選用BALB／c 雌性小鼠（3 周）進行腹部皮下和腿部肌肉注射免疫，初次免疫時使用弗氏完全佐劑與1 mg·mL－1的1.2 合成的ENR－BSA、DAN－BSA、SARA－BSA 等量混合乳化，后續改用弗氏不完全佐劑作為乳化劑，隔1 周免疫1 次，共進行6 次免疫，最后1 次不使用乳化劑乳化，按100 μL／只的劑量給藥.

1.3.2 新西蘭大白兔免疫

選用新西蘭大白兔（2 kg）進行背部皮下注射免疫，免疫次數和乳化方法同1.3.1 所述，所用免疫原為ENR－BSA、DAN－BSA，按1 mL／只的劑量給藥.

1.3.3 血清評價

將所得鼠抗血清進行icELISA 實驗，測定其效價，以確定是否有抗體產生； 將所得的兔抗血清進行icELISA 實驗，篩選出高效的特異性強的抗體及檢測抗原，用于后續建立icELISA 方法.

1.4 最佳工作條件的優化

1.4.1 最佳包被液稀釋度和抗體稀釋度

1）農機裝備水平高。主要表現為裝備標準高，配套農具數量多；科技含量高，自動化、智能化、機電液一體化程度高。

使用棋盤滴定法，對酶標板橫列進行劃分，因素為抗體稀釋濃度，同一倍數設2 列，使用PBST 溶液按1、2、4、8、16、32 k 倍對一抗進行稀釋； 再對豎列進行劃分，因素為包被原稀釋度，每個稀釋度設1 橫，使用包被緩沖液按1、2、4、8、16、32、64、128 k 倍對1 mg·mL－1的包被原進行稀釋，進行icELISA 實驗，結合ODmax值和IC50值對比，確定最佳包被稀釋度及一抗稀釋度.

1.4.2 一抗抗原最佳競爭時間

在37℃條件下分別競爭30、40、50 和60 min，進行icELISA 實驗，結合ODmax值和IC50值對比，確定一抗抗原最佳競爭時間.

1.4.3 酶標抗體最佳稀釋度

使用PBST 溶液對酶標抗體進行3、4、5、6 k 倍稀釋，進行icELISA 實驗，結合ODmax值和IC50值對比，確定酶標抗體最佳稀釋度.

1.5 標準曲線的繪制

設置恩諾沙星標準溶液的質量濃度梯度為0.05、0.25、1、4、20、100、500 μg·mL－1，以恩諾沙星標準品溶液質量濃度的常用對數值為x，實驗所得的OD 值為y，在Origin 8.5 軟件內繪制標準曲線，然后對所得的曲線使用4 參數對數方程進行擬合［17］，得到50%抑制值（IC50）和線性范圍（IC20～IC80）.

1.6 特異性測試

分析7 種恩諾沙星結構類似物：達氟沙星（DAN）、沙拉沙星（SARA）、氧氟沙星（OFL）、環丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、噁喹酸（OXO）、氟甲喹（FLU）與一抗的交叉反應，計算交叉反應率［18］. 計算公式如下：

2 結果

2.1 人工抗原的鑒定

使用碳化二亞胺法將恩諾沙星與BSA 偶聯作為免疫抗原，與OVA 偶聯作為包被抗原，紫外吸收光譜圖如圖1 所示. 由圖1 可以看出，經過偶聯的人工抗原的峰值所在的位置較BSA、OVA 相比往左偏移，且2 種人工抗原所在的吸收光譜各自都在半抗原ENR 和偶聯蛋白BSA、OVA 之間，由此可以判斷，半抗原ENR 成功偶聯到載體蛋白BSA、OVA 上.

圖1 ENR、BSA、OVA、ENR－BSA 和ENR－OVA紫外掃描圖譜

2.2 血清評價

2.2.1 鼠抗血清

6 組鼠抗血清的效價結果如表1 所示，達氟沙星的效價最高（1∶125 000），恩諾沙星（1 ∶27 000）其次，均可用于新西蘭大白兔的免疫. 效價亦稱滴度，指某種抗血清與相應的抗原發生沉淀反應或凝集反應的能力，一般以顯現反應的最高稀釋度來表示.

2.2.2 兔抗血清

2 組兔抗血清的效價結果如表1 所示，恩諾沙星效價較達氟沙星高，因此使用兔抗恩諾沙星血清來開發用于檢測恩諾沙星的icELISA. 其中，抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：

2.3 icELISA 條件的優化

棋盤滴定法優化包被抗原稀釋倍數和一抗稀釋倍數，單因素實驗優化一抗抗原競爭反應時間、二抗稀釋倍數，通過ODmax和IC502 個指標參考，從而得出最優的條件參數. 其中， ODmax值為標本最大吸光值，IC50為半數抑制濃度.

表1 血清效價結果

2.3.1 最佳包被稀釋度及抗體稀釋度的確定

根據棋盤滴定法設計對包被原和一抗進行一系列的梯度稀釋，從中選擇OD 值在1.0 ～1.5 的3 組進行icELISA 實驗，即A 組（64 000／16 000）、B 組（128 000／8 000）和C 組（32 000／32 000）（包被原稀釋倍數／一抗稀釋倍數），最終獲得的ODmax和IC50如表2 所示. 由表2 可知，當包被原稀釋1∶64 000，一抗稀釋1∶16 000時所得的標準曲線ODmax值相對穩定在1.0～1.5 之間，且IC50值相對較小，因此確定本設計使用的icELISA 方法的包被原稀釋1∶64 000，抗體稀釋1∶16 000.

表2 包被原稀釋度及一抗稀釋度的選擇

2.3.2 一抗抗原最佳反應時間的確定

設置一抗抗原反應時間（30、40、50 和60 min），進行icELISA 實驗，實驗所得的ODmax和IC50如表3 所示.由表3 可知，一抗抗原反應時間為60 min 時的IC50相對較低，且ODmax又相對穩定在1.0～1.5 之間，因此選擇60 min 作為一抗抗原抗的反應時間.

2.3.3 酶標抗體最佳稀釋度的確定

設計的酶標抗體使用PBST 緩沖液稀釋1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 和1∶6 000，進行icELISA 實驗，實驗所得的ODmax和IC50如表3 所示. 由表3 可知，酶標抗體稀釋倍數為5 000 倍時的IC50相對較低，且ODmax相對穩定在1.0～1.5 之間，因此選擇酶標抗體稀釋1∶5 000 作為酶標抗體最佳稀釋倍數.

表3 競爭時間和酶標抗體稀釋度的選擇

2.4 icELISA 的標準曲線

結合2.3 優化的結果，最終得到本設計建立的icELISA 方法的最佳工作條件：使用包被緩沖液將人工抗原ENR－OVA 稀釋1 ∶64 000，在37 ℃恒溫水浴條件下孵育12 h，使用PBST 溶液將一抗稀釋1∶16 000；用PBS 溶液將藥物按0.05、0.25、1、4、20、100、500 μg·mL－1濃度進行梯度稀釋，一抗與抗原競爭反應時間為60 min，使用PBST 溶液將酶標抗體稀釋1∶5 000，進行icELISA 實驗，按1.5 方法繪制抑制曲線，如圖2 所示，IC50為4.539 μg·mL－1，線性范圍（IC20～IC80）為0.595～34.632 μg·mL－1.

圖2 抗恩諾沙星抗體標準曲線

2.5 交叉反應的鑒定

一抗與7 種恩諾沙星結構類似物的交叉反應率如下表4 所示. 由表4 可知，兔抗恩諾沙星血清與CIP、NOR、OFL 都有較高的交叉反應率，均超過100%，與DAN、FLU、OXO 無明顯的交叉反應，說明所建立的icELISA 方法除對恩諾沙星之外，對CIP、NOR、OFL、SARA 也有較好的識別作用，可以實現這幾種藥物的同時檢測.

表4 抗ENR 抗體與7 種Qus 的CR

不同的國家和衛生組織根據自身情況對檢測食品中恩諾沙星的殘留情況制定了不同的限量標準［19－20］，具體如表5 所示. 美國對恩諾沙星的檢測要求最高，不允許檢出； 中國對恩諾沙星的最大殘留限量要求低于一些國外標準，為100 μg·kg－1. 依據中國標準，本測試方法的靈敏度還可以通過制備相應的單克隆抗體建立檢測方法來提高.

表5 恩諾沙星的最大限量標準

3 結論

合成并鑒定了人工免疫原和包被原，通過免疫BALB／c 小鼠初步篩選了可用的免疫原，進一步免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體. 人工抗原ENR－OVA 稀釋1∶64 000，在37 ℃恒溫水浴條件下孵育12 h，一抗稀釋1 ∶16 000，一抗與抗原競爭反應60 min，酶標抗體稀釋1∶5 000 時最佳. 本方法的IC50為4.539 μg·mL－1，線性范圍（IC20～IC80）為0.595～34.632 μg·mL－1； 與DAN、FLU、OXO 無明顯的交叉反應，說明所建立的icELISA 方法除對恩諾沙星之外，對CIP、NOR、OFL、SARA 有較好的識別作用，可以實現這幾種藥物的同時檢測.