椰子油降解菌的篩選及降解條件優化

黃懷興，鄧毛程，李靜，吳林杰，蔡亮，王富程，黃潔華，林鏗淳，廖民聰

(廣東輕工職業技術學院 食品與生物技術學院，廣東 廣州，510300)

椰蓉是椰肉榨汁后的副產物，油脂、蛋白質、膳食纖維質量分數分別為42.6%、4.2%和23.2%[1]。研究表明，膳食纖維具有增加飽腹感、促進腸道消化、預防便秘、降低血糖、降低血清膽固醇等功效，被譽為“第七大營養素”[2-4]。椰子蛋白中氨基酸種類有18種，包含了人體必需的8種氨基酸，具有降血脂、降低膽固醇、提高免疫力等功效[5-8]。因此，椰蓉具有極高的綜合利用價值。

據調查，由于人們過多地攝入脂肪、糖分等高能量物質，我國超重、肥胖的成年人比例超過30%[9]，控制體重用配方食品已成為一類重要食品[10]。膳食纖維和蛋白質是控制體重用配方食品的兩大基礎營養物質[11-12]，椰蓉若經過脫脂處理，將成為控制體重用配方食品的優質原料。椰蓉脫脂方法有化學法、酶法和發酵法，其中化學法是最常用的方法[13-14]，采用化學法容易產生有機溶劑殘留的現象，而采用酶法和發酵法則相對安全。目前已有一些關于油脂生物降解的研究報道[15-18]，但能否應用于椰蓉脫脂，關鍵在于菌種是否被允許用于食品領域。本研究擬篩選具有食品安全性的椰子油降解菌種，并分析該菌種的降解特性，為椰蓉脫脂以及綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種篩選材料：自然發酵5 d的椰漿；椰子油，菲律賓椰來香精煉食用椰子油；蛋白胨、酵母膏、瓊脂，市售生化試劑；正己烷、尿素、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、(NH4)2SO4等，市售分析純試劑；聚合酶鏈式反應引物和基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；Taq脫氧核糖核酸聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸，大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-100B-Z生化培養箱，，濟南來寶醫療器械有限公司；ZHWY-C2112F雙層可編程恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；101型電熱鼓風干燥箱，廣州市康恒儀器有限公司；S-3000N掃描電鏡，日本日立公司； TprofessionalPCR儀，德國Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀，美國Syngene公司。

1.3 馴化培養與平板分離

馴化培養基(g/L)：椰子油50，酵母膏10，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調節pH 6.0。馴化培養基經滅菌、冷卻后，接入10%(體積分數)的自然發酵椰漿，于28 ℃、200 r/min的條件下培養96 h，再轉接入新鮮的馴化培養基。重復操作馴化培養2次。

平板分離培養基(g/L)：蛋白胨20，牛肉膏10，氯霉素0.1，瓊脂 20，調節pH 6.0。制作平板后，將無菌的椰子油涂布在平板上，再將馴化培養液的稀釋液涂布于平板上，置于28 ℃下培養72 h。

斜面培養基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)。用接種針挑取平板上60個單菌落，分別接入斜面培養基，于28 ℃下培養至長出菌苔，置于4 ℃冰箱保藏備用。

1.4 搖瓶篩選

搖瓶篩選培養基(g/L)：椰子油40，酵母膏5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調節pH 6.0。搖瓶篩選培養基經滅菌、冷卻后，分別接入60株斜面菌種，置于28 ℃、200 r/min的條件下培養120 h。然后，測定培養液中油脂殘余量，計算椰子油降解率，優選出降解率最高的菌株。

1.5 菌種鑒定

觀察優選菌株的菌落形態，并利用掃描電鏡觀察菌體形態。按文獻提供的方法[19-21]，用氯仿-異戊醇法提取該菌種的DNA，采用通用引物NL1 (5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL4 (5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)，用PCR擴增26S rDNA的D1/D2區域。PCR反應體系(50 μL)：DNA模板 2 μL，引物NL1/NL4(10 μmol/L)各2 μL，2×Tap PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴增條件為95 ℃變性1 min，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，循環36次，72 ℃延伸10 min。擴增產物經凝膠電泳實驗后，送至測序公司測序。將測序結果進行BLAST同源性比對，并使用軟件MEGA6.0以Neighbor-Joining方法構建系統發育樹。

1.6 不同氮源優選試驗

種子培養基(g/L)：葡萄糖25，酵母膏10，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調節pH 6.0。滅菌、冷卻后，接入斜面菌種，于28 ℃、200 r/min的條件下培養20 h。

氮源篩選培養基(g/L)：椰子油40，不同氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl 5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調節pH 6.0。分別以不同氮源配制培養基，滅菌、冷卻后，接入10%的種子培養液(體積分數)，于28 ℃、200 r/min的條件下培養120 h，優選最佳氮源。

1.7 氮源用量優選試驗

以最佳氮源配制椰子油降解培養基，該氮源的添加量分別為2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 g/L，調節pH 6.0，按1.6所述方法進行接種以及培養，優選氮源的最佳添加量。

1.8 添加其他碳源試驗

按照氮源最佳的復配方案配制椰子油降解培養基，分別添加0、2.5、5、7.5、10 g/L的葡萄糖、檸檬酸鈉，調節pH 6.0，按1.6所述方法進行接種以及培養，優選最佳的外加碳源及用量。

1.9 油脂殘余量測定

參照文獻油脂提取方法[22]，用等體積的氯仿對培養液進行萃取2次，取下層溶液，用0.2 μm有機濾膜抽濾，除去菌體，獲取萃取液，70 ℃下加熱蒸發去除氯仿，得到殘余油脂。稱量殘余油脂質量，計算椰子油降解量以及降解率。

1.10 生物量測定

將離心分離所得的菌體置于105 ℃的烘箱中，干燥至恒重，稱量質量，計算發酵液中的干菌體濃度[23]。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

經搖瓶篩選，60個菌株對椰子油降解率的分布為2.78%～63.75%，有7個菌株的降解率>50%，如圖1所示。其中，菌株YD22在60個菌株中的椰子油降解率最高，故優選為進一步研究的對象。該菌株的菌落如圖2所示，菌落呈乳白色，邊緣不整齊，表面干燥而呈現出皺褶。利用普通顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌體，如圖3所示，菌體呈現橢圓型，有芽體，具有酵母形態特征。

將菌種YD22的26S rDNA進行擴增與測序，再將測序結果在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在線數據庫上進行比對，發現該菌與很多解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)的相似度達到99%。通過構建系統發育樹，如圖4所示，菌種YD22與YarrowialipolyticaZIM 2416(NCBI登錄號HE660067.1)的親緣關系最近，故被鑒定為解脂亞羅酵母。解脂亞羅酵母具有常見釀酒酵母不具備的特性，通常被用于檸檬酸、異檸檬酸、蛋白酶、脂肪酶、芳香型化合物、二元羧酸、單細胞油脂、生物表面活性劑等生物合成的研究[24-25]。解脂亞羅酵母能夠廣泛利用糖類、醇類以及一些疏水性化合物作為碳源，近年來又經常被用于油脂污染廢水生物修復、油作物廢料綜合利用等領域[26-27]，菌種YD22所具有的椰子油降解性能與這些研究結果是一致的。另外，解脂亞羅酵母被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)認為是具有食品安全性的微生物[28]。

圖1 降解率大于50%的菌株Fig.1 Strains of degradation rate above 50%

圖2 菌種YD22的菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain YD22

圖3 菌種YD22的電子顯微鏡掃描照片(×10 000)Fig.3 Scanning electronmicroscope(SEM) photograph of strain YD22

圖4 菌種YD22的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YD22

2.2 不同氮源對降解的影響

如圖5所示，椰子油降解率與生物量呈現出一定的相關性。當環境條件和生長階段相同時，菌體對椰子油具有比較穩定的比利用速率，單位體積內菌體量越大，椰子油的利用率也越大。因此，較大的生物量可以促進椰子油降解。已有研究表明，酵母浸粉、玉米漿等有機氮源不僅含有微生物生長所需的氮素物質，還含有比較豐富的生長因子，對酵母增殖有利[29-30]。從圖5可以看出，有機氮源在促進酵母增殖和椰子油降解等方面的效果明顯優于無機氮源。其中，以酵母膏為氮源時，生物量與椰子油降解率最大，故選擇酵母膏作為最佳氮源。

圖5 不同氮源對椰子油降解的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on degradation of coconut oil

2.3 酵母膏用量對降解的影響

以不同用量的酵母膏配制培養基，發酵結果如圖6所示。在一定范圍內，隨著酵母膏用量的增加，生物量與椰子油降解率均呈現出不斷增大的趨勢。再次證明，椰子油降解與酵母增殖具有一定相關性，適當增加酵母膏用量，有利于促進酵母增殖，從而可以提高椰子油降解率。當酵母膏質量濃度增加至10 g/L時，氮源已不是微生物生長與代謝的限制因素，此時的椰子油降解率與生物量趨于最大，繼續增大酵母膏用量，對酵母增殖和椰子油降解的影響微弱。因此，酵母膏的最佳用量選擇為10 g/L。

圖6 酵母膏用量對椰子油降解的影響Fig.6 Effect of yeast extract dosage on degradation of coconut oil

2.4 外加碳源對降解的影響

在培養基中分別添加葡萄糖和檸檬酸鈉，結果如圖7和圖8所示。葡萄糖和檸檬酸鈉是容易利用碳源，它們被適量添加后，能夠優先被酵母利用，對促進酵母增殖與椰子油降解具有一定作用。但是，在無外加碳源的培養基中，最終pH值下降至3.75，說明培養后期的pH已經不適宜酵母菌代謝。葡萄糖是生理酸性物質，添加量過大時，會引起pH較大幅度下降，對酵母進一步增殖和生理代謝反而不利。從圖7可以看出，葡萄糖用量不宜過大，當葡萄糖用量為5 g/L時，生物量和椰子油降解率達到最高，干菌體質量濃度為20.15 g/L，椰子油降解率為76.54%。檸檬酸鈉是生理堿性物質，其代謝會引起pH上升，將對椰子油代謝所引起pH下降具有一定的調節作用。從圖8可以看出，隨著檸檬酸鈉用量逐漸增加，生物量和椰子油降解率也逐漸增大。當檸檬酸鈉用量為7.5 g/L時，干菌體質量濃度和椰子油降解率達到最大，分別為22.49 g/L和85.76%。而后，檸檬酸鈉用量繼續增加時，生物量和椰子油降解率反而下降。在質量濃度為10 g/L檸檬酸鈉的培養基中，雖然最終pH值顯示為6.12，但是，檸檬酸鈉被利用過程中的pH卻超過了8.0，對酵母產生了抑制作用。通過比較無外加碳源、添加葡萄糖、添加檸檬酸鈉的降解效果，優選質量度為7.5 g/L 檸檬酸鈉為最佳外加碳源，其降解率是無外加碳源的1.2倍。在已報道的一些油脂降解研究中[15-16,31]，油脂初始質量濃度通常低于10 g/L，油脂降解率一般低于80%。與這些已知的油脂降解菌相比，本實驗的椰子油初始質量濃度與降解率較高。

圖7 葡萄糖用量對椰子油降解的影響Fig.7 Effect of glucose dosage on degradation of coconut oil

圖8 檸檬酸鈉用量對椰子油降解的影響Fig.8 Effect of sodium citrate dosage on degradation of coconut oil

3 結論

從自然發酵椰漿中，篩選獲得1株椰子油高效降解菌株YD22。經過菌落形態、菌體形態與26S rDNA鑒定，該菌株被確定為解脂亞羅酵母。菌種YD22對椰子油的降解率與其生物量具有相關性，生物量越高，越有利于微生物降解椰子油。在氮源篩選試驗中，酵母膏對酵母增殖和椰子油降解的促進作用最顯著，被優選為最佳氮源，其最佳用量為10 g/L。在酵母膏為氮源的椰子油培養基中，適量添加葡萄糖和檸檬酸鈉，可提高生物量和椰子油降解率。其中，在40 g/L椰子油培養基中，添加7.5 g/L檸檬酸鈉時，椰子油降解效果最好，降解率達到85.76%，明顯高于無外加碳源的培養基。與已知的油脂降解菌相比，菌種YD22是可用于食品的菌種，且對椰子油具有很強的降解能力，在食品工業中具有應用價值。同時，氮源和外加碳源的研究結果，為油脂降解領域的研究與生產提供參考。