羧甲基纖維素鈉對綠豆分離蛋白乳液穩定性的影響

任思，劉麗婭，龐淑婕，李娜娜，周素梅，王立*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(中國農業科學院農產品加工研究所，北京，100193)

隨著人們對豆類蛋白營養價值認識的提高，豆類蛋白的需求量激增，大豆蛋白和豌豆蛋白受到廣泛關注[1-2]。綠豆蛋白是綠豆中除淀粉外含量第二豐富的營養成分(20%～33%)[3]，氨基酸組成平衡[4]，營養價值高。然而，目前食用綠豆蛋白的途徑仍然是將綠豆加工成不同類型的食物，如湯和粥等[5]。此外，綠豆蛋白常被作為綠豆淀粉加工的副產品，應用于飼料工業，造成了綠豆蛋白資源的嚴重浪費。

食品乳液通常是以蛋白質、多糖、乳化劑、油脂為主體，經過均質形成的一類分散體系，是食品加工中最復雜的體系之一[6]，狀態接近真實的乳飲料。其在加工過程和貨架期內的穩定性容易受環境因素，如溫度、離子強度及pH等影響[7]，表現為脂肪上浮、蛋白沉淀、質感粗糙等，嚴重影響到食品的外觀和口感，是食品工業中亟待解決而又難以徹底解決的重要技術問題。目前，關于綠豆分離蛋白(mung bean protein isolates，MBPI)應用于食品乳液的研究和應用尚未見報道，這與MBPI功能特性較差，尤其是在接近其等電點附近時(約為pH 4.6)溶解性和乳化性不佳密切相關[8]。

陰離子多糖常被添加到蛋白穩定的酸性乳飲料中，通過靜電作用和空間位阻效應提高乳液的穩定性，減緩液滴聚集[9]，改善產品的感官特性[10]。羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)是酸性乳飲料中應用廣泛的穩定劑，是由D-吡喃葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵鏈接而成的陰離子型線性多糖[11]。CMC與蛋白在水相體系及乳液體系中的相互作用已有較為深入的研究[9,12]。但CMC與MBPI在乳液體系中的相互作用尚不清楚。基于此，本文擬研究CMC對MBPI乳液穩定性的影響，通過考察不同pH、CMC濃度和加熱溫度下乳液粒徑、聚集程度、ζ-電位、黏度及分層穩定性的變化，揭示CMC引起MBPI乳液穩定/失穩的內在機制。為綠豆蛋白資源在植物基乳品中的開發利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫皮綠豆，淶水縣金谷糧油食品有限公司；葵花籽油，購于北京物美超市；CMC，常熟威怡科技有限公司；HCl、NaOH，國藥集團化學試劑公司；磷酸鹽緩沖液、尼羅紅、尼羅藍，北京Solarbio生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pH計(pH400)，美國Alalis公司；高速分散器(XHF-DY)，寧波新芝生物科技股份有限公司；高壓均質機(SCIENTZ-150)，寧波新芝生物科技股份有限公司；激光粒度分析儀(Mastersizer 2000)，英國Malvern公司；Zeta-電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90)，英國Malvern公司；流變儀(Physica MCR301)，奧地利Anton Paar有限公司；穩定性分析儀(Turbiscan Lab?Expert apparatus)，法國Formulaction公司；Carl Zeiss蔡司激光共聚焦顯微鏡880(LSM T-PMT)，德國Carl Zeiss有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MBPI的制備

參考DU等[13]的方法并稍做修改。將脫皮綠豆研磨粉碎至60 目，以質量比為1∶15的比例分散于去離子水中，調節pH至9.0。在40 ℃，600 r/min下攪拌1 h后4 000 r/min離心20 min。收集上清液調節pH至4.5，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀重新分散于去離子水中，調節pH至7.0。溶液透析24 h除去多余的鹽離子后凍干，凍干物即為MBPI。

1.3.2 乳液的制備

將MBPI和CMC分別分散在去離子水中，室溫下攪拌3 h后置于4 ℃過夜以確保完全水化，得到質量分數為5%MBPI和1%CMC母液。將MBPI、CMC溶液及葵花籽油按照一定比例混合，添加去離子水，配制成MBPI和葵花籽油質量分數為2%，CMC添加量(質量分數)分別為0%、0.2%、0.4%和0.5%的混合液。將混合液于10 000 r/min下高速剪切1 min后，于常溫、40 MPa下高壓均質1次，制備成乳液。用HCl和NaOH調節pH，得到pH 7.0 和4.5的乳液，再次在相同條件下均質后，置于4 ℃條件下貯藏備用。

1.3.3 粒徑的測定

采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定乳液液滴粒徑的大小。參數設置為：分析模式通用；進樣器名Hydro 2 000MU(A)；顆粒折射率1.520；顆粒吸收率0.10；分散劑水；分散劑折射率1.330；泵的轉速2 500 r/min；測定溫度25 ℃。實驗采用體積平均直徑(volume weighted average diameter)d43表征液滴粒度的大小。

1.3.4 ζ-電位的測定

采用Zetasizer Nano-ZS90電位測定儀測定乳液液滴的ζ-電位，參考LIU等[14]的方法并稍作修改。測定前，樣品采用與其pH相同的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋5倍，測定溫度25 ℃。

1.3.5 黏度的測定

根據WEI等[15]的方法并稍做修改后，采用Physica MCR301流變儀測定乳液的黏度隨剪切速率的變化。測定選用不銹鋼平行板轉子(pp50Ti)，設定間距為0.500 mm，測定溫度25 ℃，平衡時間3 min，剪切速率從0.1到100 s-1。加樣時直接把樣品吸取在平板上，使其分布均勻并防止氣泡產生。

1.3.6 放置穩定性的測定

采用Turbiscan Lab穩定性分析儀測定，結果記錄為Turbiscan穩定性指數(turbiscan stability index，TSI)，其中，TSI越小，乳液越穩定。取20 mL新制乳液加入圓柱形玻璃小瓶中，并置于穩定性分析儀中，測定溫度25 ℃，測定時長24 h，每隔1 h掃描1次，記錄數值。

1.3.7 微觀結構的觀察

激光共聚焦的測定參考趙謀明等[16]提到的方法并略微修改，采用萊卡激光共聚焦儀器觀測乳液的微觀結構。上樣前，在1 mL樣品中加入40 μL混合染料(0.02% 尼羅紅和0.1% 尼羅藍)，充分混合均勻。選用63×油鏡，在顯微鏡下初調焦，找到乳液液滴分散平面。選擇488 nm的Ar離子和633 nm的He/Ne 離子激光預掃描，采集熒光圖像。所有液滴熒光圖像按1 024×1 024像素，3×zoom進行采集。然后用激光掃描共聚焦顯微鏡LAS AF Lite軟件進行圖像分析與數據處理。

1.3.8 熱處理對MBPI乳液穩定性的影響

將新鮮制備的乳液分別置于60、80及100 ℃下加熱30 min，冷卻至室溫，放置24 h后，對其粒徑、ζ-電位、表觀黏度、穩定性指數及乳液微觀結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 CMC和pH對MBPI乳液ζ-電位的影響

如圖1所示，pH 7.0條件下，添加CMC對MBPI乳液的ζ-電位未產生顯著影響。這是因為在中性條件下，MBPI穩定乳液液滴與CMC分子均帶負電荷，存在較強的靜電斥力，不利于CMC吸附在液滴表面，兩者之間通常很少形成靜電復合物，所以顆粒的ζ-電位不會產生明顯變化。在pH 4.5條件下，由于MBPI處于其等電點附近(～pH 4.6)，蛋白發生較為嚴重的絮凝，導致乳液失穩。隨著CMC添加量的增加，帶有負電荷的CMC與乳液液滴表面帶有正電荷的MBPI發生靜電吸附，乳液ζ-電位由正值轉變為負值，且絕對值顯著增加，這是由于帶負電荷的多糖與帶正電荷的綠豆蛋白之間存在靜電絡合作用，兩者形成了靜電復合物，所以顆粒ζ-電位絕對值明顯增加，液滴間的靜電排斥作用得到增強。KOUPANTSIS等[17]報道了酸性條件下帶負電荷的CMC吸附到帶正電荷的乳清蛋白表面和酪蛋白酸鈉表面，與本實驗結果類似。

圖1 CMC添加量和pH對MBPI乳液ζ-電位的影響Fig.1 Effects of CMC concentration and pH on the ζ-potential of MBPI-stabilized emulsions

2.2 CMC和pH對MBPI乳液聚集行為的影響

如圖2所示，在pH 7.0條件下，隨著CMC添加量由0提高到0.5%，MBPI乳液液滴粒徑由2.35 μm增加至4.16 μm。圖3-a激光共聚焦顯微觀測結果也證實添加CMC引起液滴發生了不同程度的絮凝，并產生微觀相分離。這是由分散相中未吸附多糖分子誘發的液滴排斥絮凝所造成[16]，這種狀態的絮凝液滴間相互作用力較弱，容易被稀釋、振蕩、攪拌等物理作用破壞，一般是可逆的[18]。

在pH 4.5條件下，未添加CMC的乳液發生了嚴重的絮凝(圖3-b)，液滴的粒徑達到33.5 μm(圖2)。這主要是因為MBPI在等電點附近電荷量接近0，液滴之間的靜電斥力不足以克服范德華力和疏水相互作用等吸引力，從而發生聚集。CMC的添加可顯著降低乳液液滴粒徑，且當CMC添加量增加到0.4%時，液滴分散均勻，粒徑減小到1.08 μm，蛋白在酸性條件下的聚集得到抑制(圖3-b)。這與CMC在液滴表面的吸附，提高了液滴間的靜電排斥和空間位阻效應密切相關。LIU等[19]也證實了添加0.2%的高甲氧基果膠或SSPS都可以抑制酪蛋白酸鈉乳液液滴的聚集，這與本實驗報道現象相一致。

圖2 CMC添加量和pH對MBPI乳液粒徑的影響Fig.2 Effects of CMC concentration and pH on the mean droplet diameter (d43) of MBPI-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖3 CMC添加量和pH對MBPI乳液微觀結構的影響Fig.3 Effects of CMC concentration and pH on the microstructure of MBPI-stabilized emulsions注：圖中紅色為油脂；綠色為蛋白

2.3 CMC和pH對MBPI乳液黏度的影響

根據斯托克斯定律，較高的黏度有助于阻止或延遲蛋白包裹液滴之間的相互聚集[20]。由圖4可知，pH 7.0條件下，未添加CMC的乳液黏度很低，隨著CMC添加量增加，乳液的黏度逐漸增加。而在pH 4.5條件下，未添加CMC的乳液具有較高的黏度，這可能與體系發生嚴重的絮凝有關。隨著CMC濃度的增加，體系黏度顯著降低。推測這可能與CMC吸附于MBPI穩定的液滴表面，造成連續相中多糖濃度的降低有關。而當CMC添加量達到0.5%時，體系的黏度顯著升高。圖1的結果也表明，當CMC添加量超過0.4%時，液滴的ζ-電位不再增加。表明此時，CMC在MBPI穩定的液滴表面發生了飽和吸附。因此，添加0.5%CMC時，過量的CMC將分散于分散相中，引起黏度升高[20]。

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖4 CMC添加量和pH對MBPI乳液黏度的影響Fig.4 Effects of CMC concentration and pH on the viscosity of MBPI-stabilized emulsions

2.4 CMC和pH對MBPI乳液穩定性的影響

由圖5可知，在pH 7.0條件下，未添加CMC的乳液具有較好的穩定性，在25 ℃放置24 h，未產生明顯的分層現象(圖6)。添加0.2%CMC引起乳液的分層，樣品底部出現水析層。隨著CMC添加量的增加，穩定性得到了增強，水析現象得到抑制。在pH 4.5條件下，MBPI乳液發生嚴重的失穩，分層現象嚴重。與中性條件下的變化趨勢相一致，當添加少量CMC(0.2%)時，TSI增加，穩定性顯著降低。而當CMC添加量提高到0.4%以上時，TSI明顯減小，乳液具有很好的穩定性，未出現分層。ZHAO等[21]研究顯示當乳鐵蛋白乳液中添加0.05%～0.15%大豆多糖或甜菜果膠時，乳液發生橋連絮凝，而添加量超過0.35%時，乳液具有較好的穩定性。

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖5 CMC添加量和pH對MBPI乳液TSI的影響Fig.5 Effects of CMC concentration and pH on the TSI of MBPI-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖6 CMC添加量和pH對MBPI乳液分層情況的影響Fig.6 Effects of CMC concentration and pH on the stratification of MBPI-stabilized emulsions

2.5 熱處理對MBPI-CMC乳液穩定性的影響

如圖7所示，在pH 7.0和pH 4.5條件下，添加0.4%CMC的MBPI乳液在本研究所考察的熱處理溫度下，均未出現明顯分層現象。如圖8所示， TSI測定的結果表明，當加熱溫度由60 ℃增加到80 ℃時，不同pH體系的穩定性未發生明顯變化；隨著加熱溫度繼續提高到100 ℃，體系的穩定性顯著降低。如圖9所示，粒徑測定的結果表明，對于中性乳液，加熱對液滴粒徑的影響較小，但加熱至100 ℃，體系發生明顯的微觀相分離(圖10)。同時，pH 7.0條件下加熱，未對樣品的黏度產生顯著影響(圖11)。對于pH 4.5的乳液體系，當溫度增加至80 ℃和100 ℃，液滴粒徑顯著增加(圖9)。圖11黏度結果也顯示加熱引起了液滴粒徑的增加和絮凝，導致樣品表觀黏度有一定程度的增加。

圖7 熱處理溫度對MBPI-CMC乳液分層情況的影響Fig.7 Effect of temperature on the stratification of MBPI-CMC-stabilized emulsions

3 結論

(1) 在pH 7.0條件下，CMC與吸附于乳液液滴表面的MBPI未發生明顯吸附。CMC主要存在于分散相中，誘導液滴發生排斥絮凝。當CMC添加量較低(≤0.2%)，其對體系黏度的貢獻不足以抵抗液滴間的排斥作用時，體系產生失穩現象，樣品底部出現肉眼可見的水析層。隨著CMC添加量增加，體系黏度增加，宏觀的相分離被抑制。

a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液圖8 熱處理溫度對MBPI-CMC乳液TSI的影響Fig.8 Effect of temperature on the TSI of MBPI-CMC-stabilized emulsions

圖9 熱處理溫度對MBPI-CMC乳液粒徑的影響Fig.9 Effect of temperature on the mean droplet diameter (d43) of MBPI-CMC-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液圖10 熱處理溫度對MBPI-CMC乳液微觀結構的影響Fig.10 Effect of temperature on the microstructure of MBPI-CMC-stabilized emulsions注：圖中紅色為油脂；綠色為蛋白

圖11 熱處理溫度對MBPI-CMC乳液黏度的影響Fig.11 Effect of temperature on the viscosity of MBPI-CMC-stabilized emulsions

(2) 在pH 4.5條件下，CMC與液滴表面帶有相反電荷的MBPI發生靜電吸附作用，當多糖濃度≥0.4% 時，多糖通過靜電作用和空間位阻效應穩定液滴，獲得分散均勻的乳液體系。此時CMC對體系的黏度貢獻較小，不是酸性乳液穩定性提高的關鍵因素。

(3) 在熱處理條件下(60～100 ℃，30 min)，添加0.4%CMC的中性和酸性MBPI乳液均發生了絮凝，并且酸性條件下，液滴粒徑增加較為顯著。但不同溫度下處理的樣品，均未發生宏觀的失穩現象,表明CMC穩定的MBPI乳液具有一定的熱穩定性。