重金屬對鯽魚的毒性及其相關生物標志物的研究

劉小真，鐘瑾慧，熊 戩

(南昌大學資源環境與化工學院；鄱陽湖環境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌 330031)

工業化進程的加快以及人類生產活動的不規范化等多因素使得環境中存在大量的重金屬污染物，由此導致的生態危害和健康損害事件時有發生[1]。重金屬是一類有潛在危害的重要污染物，它極難降解、易被生物富集并有生物放大效應等特點，有較大的生態危害性[2]。

環境中廣泛存在鉛、鎘污染，過量攝入鉛、鎘對水生生物產生系列毒性效應，引起魚體生物反應異常(游動能力下降、身體側翻)，破壞魚體器官組織結構、引起組織病變，包括改變酶活性、損傷細胞器、致死等[3]；因此研究重金屬的生態毒性尤為重要。鉛、鎘在低濃度下可引起機體的氧化應激和氧化損傷[4-5]，通過檢測魚體內相關指標可以判斷其受重金屬的影響程度。胡蓉[6]、卓麗玲[7]等研究鯽魚對Pb2+、Cd2+24 h的最大耐受質量濃度分別為15、0.54 mg·L-1，鉛、鎘引起的氧化應激可以通過抗氧化酶的活性變化來反應[8-9]。抗氧化酶是生物體受到氧化脅迫和損傷情況下的主要生物標志物，生物受到污染脅迫時會刺激體內產生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，進而誘導抗氧化酶系統的響應，其響應是為了一定程度上消除活性氧自由基，維系膜系統的穩定性，降低細胞受傷害的程度[10-11]。關于重金屬誘導魚類氧化應激的研究大多集中在毒性機制上[12]，早期預警生物標志物的研究有待加強。

1 材料與方法

1.1 蚌湖地理位置介紹

鄱陽湖位于江西省北部，地理坐標28°22′-29°45′N,115°47′-116°45′E，是一個過水性、吞吐型的淺水湖泊[14]。蚌湖位于鄱陽湖西北，屬于鄱陽湖邊緣的一個天然湖泊(29.268°-29.271°N，115.934°-115.979°E)，面積約80 km2；蚌湖及其周邊水域存在明顯的水位波動性，豐水期鄱陽湖水體越過貫通口進入蚌湖，此時蚌湖與鄱陽湖連成一整體水域，枯水期蚌湖水位降低，形成與多個外界隔離的湖泊[15]。(見圖1)

蚌湖水體pH值為7.56±0.44，水質硬度在100～130 mg·L-1，水中氧濃度保持在飽和濃度的70%～115%。參照相關文獻[15]及《土壤環境質量標準》(GB 15618—1995,2008)，蚌湖表層沉積物中Pb、Cd濃度分別達到二級、三級標準(見表1)。

表1 鉛、鎘土壤環境質量標準值/(mg·kg-1)

1.2 實驗對象的獲取及飼養

蚌湖內有豐富的鯽魚和鯉魚，鯽魚是水生生態系統食物鏈中極為重要的一環，它能夠對水環境中物理、化學和生物因素的變化做出敏銳的反應，所以在評價環境污染及生態風險中表現出突出的實用價值[16-17]。其主要優點有：分布廣泛，容易獲得；個體適中，適于實驗室飼養；是蚌湖流域水生生物優勢物種，有代表性。因此染毒實驗以鯽魚為研究對象，本研究所用鯽魚均捕獲自蚌湖，選擇鮮活、無損傷，且體型大小相似，體長(8.0±0.5)cm，體重(12.0±0.5)g。鯽魚在實驗室馴養至少7 d(期間死亡率低于10%)，實驗水質條件真實模擬蚌湖水環境狀況，水溫維持(20±2)℃，pH控制范圍為6.5～8，溶解氧量為7 mg·L-1以上，水體硬度控制在100～130 mg·L-1(CaCO3)，馴養期間每天喂食1次(喂食0.5 h后清除殘餌及糞便)，實驗前24 h停止喂食。

1.3 主要試劑及儀器

儀器：可見分光光度計(722G，上海分析儀器有限公司)、漩渦混合器(XW-80A，上海精科實業有限公司)、電熱恒溫培養箱(DRP-9163型，上海森信實驗儀器有限公司)、高速臺式離心機(GT16-3A，北京時代北利離心機有限公司)等相關基礎實驗儀器。

試劑：乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(G250)、牛血清白蛋白(BSA)等，MDA、T-SOD、MTs和ECOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 實驗設計

重金屬染毒實驗：選用對重金屬敏感的4種抗氧化酶研究鯽魚由Pb、Cd引起的氧化應激反應。為避免水環境綜合因素的影響，依據蚌湖表層沉積物重金屬污染情況及前期淡水環境中檢測的Pb、Cd含量(0.01，0.001 mg·L-1)，以《地表水環境質量標準》為依據設置Pb2+，Cd2+兩種重金屬的染毒實驗濃度，設置4個濃度梯度，最高濃度設置為Ⅴ類水質限值的5倍。具體濃度設置如表2所示。

表2 染毒試驗重金屬濃度/(mg·L-1)

鯽魚染毒實驗選取規格大小一致、反應靈敏個體隨機分為9個處理組，包括一組空白對照和兩種重金屬分別設置的四個暴露濃度組，每個處理組3個重復，每個重復10尾魚。實驗用水均為曝氣3 d以上的自來水(去除水中的溶解氯)；實驗期間pH值、水質硬度、溶解氧均符合蚌湖水質參數，水溫維持在(20±2)℃，實際鯽魚的生物量控制在≤0.5 g·L-1。采用動態染毒法，各魚缸中溶液體積均為15 L，每天更新30%的試驗液，持續曝氣，實驗期間不投餌料，染毒時間為8 d。隨機選取魚體作為供試材料，迅速解剖魚體，用吸水紙吸干組織表面水，摘取肌肉、腦、肝臟、鰓四種組織放入-20 ℃冰箱中貯存。MDA、T-SOD、MTs和ECOD等酶活性，均采用南京建成生物工程研究所的商品試劑盒測試，其對應測試步驟嚴格按照試劑盒的使用說明執行。

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1.5 組織勻漿制備

(1)稱取鯽魚組織(0.2～1.0)g在2～5 mg在冰生理鹽水中漂洗，除去血液并用濾紙吸干，放入10 mL小燒杯內；(2)將鯽魚組織在0.86%冷生理鹽水中剪碎并倒入玻璃勻漿管中，將搗桿垂直插入套管中，上下研磨數十次，充分研碎使組織勻漿化；(3)將制備好的勻漿用冷凍離心機(轉速2 000 r·min-1)離心10～15 min，收集離心后的上清液為勻漿液。

2 結果與分析

2.1 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中MDA變化情況

對鯽魚進行Pb2+、Cd2+染毒試驗，MDA測定結果如圖2所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉MDA除0.1 mg·L-1濃度處顯著高于對照組(P<0.05)，其余濃度暴露下肌肉MDA含量與對照組無明顯差異；腦組織中MDA隨濃度呈波動變化，且與對照組無顯著差異；肝臟中各濃度組MDA顯著高于對照組(P<0.05)，且與暴露濃度呈負相關關系。

隨著Cd2+濃度的逐步增加，肝臟各暴露組MDA隨Cd2+濃度升高含量增加，呈正相關且與對照組有顯著差異(P<0.05)；肌肉和腮中MDA呈相似的波動變化，都在0.01 mg·L-1濃度處出現下降現象；腦MDA隨濃度升高先增加，隨后在0.5 mg·L-1濃度處出現下降。

Pb2+、Cd2+暴露后對鯽魚各組織MDA的影響如圖2所示，由圖中可以看出Pb2+暴露下除腦組織外各組織MDA隨濃度均有先增加后下降的趨勢。魚體細胞受到氧化脅迫產生ROS，ROS容易攻擊生物膜上的磷脂、膜受體等不飽和脂肪酸類大分子物質，從而引起脂質發生過氧化[18]。MDA是脂質過氧化的最終產物，它反映了機體受氧化損傷的程度。各Pb2+暴露組實驗開始后，鯽魚肝臟和腮MDA含量顯著升高，表明Pb2+脅迫下，機體ROS含量增多造成脂質過氧化程度增強。而后暴露濃度升高，魚體無法適應高濃度暴露環境，MDA含量下降，機體受到損傷逐漸傾向于氧化狀態。Cd2+暴露下腦組織中出現同樣現象，而肝臟MDA在Cd2+暴露下表現出明顯的劑量效應關系。卓麗玲[7]、金葉飛[19]等相關研究表明，染Cd2+組隨暴露濃度的增加，鯽魚肌肉、肝臟、腮的Cd蓄積量均出現顯著增加(P<0.05)，各組織蓄積量順序為：肝臟>鰓>肌肉；肝臟組織富集系數及敏感程度大于其他組織，主要原因為肝臟是魚體蓄積重金屬及解毒的主要器官，是鎘代謝的中心區域。所以呈現出鯽魚肝臟MDA含量明顯高于其他組織。圖中看出肝臟組織在此濃度范圍內對Cd2+濃度變化敏感，能夠成為Cd污染的良好指示劑。這與王學鋒[20]等對Cd2+暴露下鯽魚肝臟MDA活性變化的相一致。

2.2 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中T-SOD變化情況

對鯽魚進行Pb2+、Cd2+染毒試驗，T-SOD活性測定結果如圖3所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉T-SOD活性隨暴露濃度先升高，而后在0.5 mg·L-1濃度處活性降低，與肌肉MDA變化趨勢一致；腦和腮組織中T-SOD呈現波動變化；肝臟T-SOD在0.01 mg·L-1處受到顯著誘導(P<0.05)，隨后活性隨濃度逐漸降低，呈負相關。

暴露于Cd2+溶液8 d后，四種組織T-SOD呈波動變化，活性均在高暴露組出現下降趨勢；肌肉與肝臟T-SOD在0.05 mg·L-1Cd2+暴露下活性下降，腦組織T-SOD在0.001 mg·L-1Cd2+暴露下受到顯著誘導(P<0.05)，隨后波動變化至對照組水平。

2.3 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中MTs變化情況

對鯽魚進行Pb2+、Cd2+染毒試驗，MTs活性測定結果如圖4所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，MTs在四種組織中酶活性均出現顯著上升趨勢(P<0.05)，腦、肝臟兩組織活性變化相似，均與暴露濃度呈正相關關系，在0.5 mg·L-1Pb2+濃度處呈現最大誘導；肌肉MTs出現先升高后在0.5 mg·L-1Pb2+濃度處活性降低；腮中活性呈現波動變化。

暴露于Cd2+溶液8 d后，肌肉、腦、肝臟中MTs活性變化趨勢一致，MTs在前3個暴露漸升高，在0.01 mg·L-1Cd2+處達到最大值且與對照組有顯著差異(P<0.05)，而后0.05 mg·L-1Cd2+濃度處活性回復至對照組水平；而鰓組織MTs隨暴露濃度增加活性升高，劑量效應關系明顯。

MTs是唯一一種在重金屬代謝中起明確作用的非酶低分子蛋白質，具有抵御氧化損傷的作用[24-25]。MTs活性變化過程與前兩種酶相似，隨暴露濃度升高MTs活性上升以應對機體毒性損傷。MTs對于重金屬脅迫具有特異性，能夠與有毒金屬如Cd、Hg相結合并清除活性氧自由基，MTs作為重金屬尤其是Cd暴露的生物標志物已廣泛應用于實踐中[26]。從圖中可以看出腦、肝臟MTs與Pb暴露濃度呈正相關關系，可以作為Pb污染的理想生物標志物；腮組織與Cd暴露濃度呈正相關，可以作為該濃度范圍內Cd暴露的良好指示劑。這與Hamza-Chaffai[27]對蛤的原位重金屬暴露研究結論一致。

2.4 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中ECOD變化情況

對鯽魚進行Pb2+、Cd2+染毒試驗，ECOD活性測定結果如圖5所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，4種組織中ECOD活性均出現先升后降的變化；腦和腮暴露組活性呈現波動變化；肌肉和肝臟活性變化均表現為先升后降。隨著Cd2+濃度的逐步增加，腦與鰓組織間ECOD活性變化一致；肌肉與肝臟中變化趨勢類似，均在0.005 mg·L-1濃度下活性最大，尤其肝臟ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+暴露下受到顯著誘導(P<0.05)，明顯高于其他暴露組。

ECOD在各組織中未表現出明顯規律。肝臟ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+濃度下急劇增加至最大值，ECOD能夠催化細胞色素P450酶系CYP的活性，CYP是生物體內重要的代謝解毒酶，說明該濃度處酶活性顯著誘導以催化CYP的活性達到機體解毒的目的；而后濃度升高酶活性下降表明機體在該暴露濃度下逐漸氧化損傷。

3 結論

重金屬Pb、Cd對水體鯽魚染毒實驗研究表明：

在0.5 mg·L-1Pb2+濃度范圍內鯽魚腦和肝臟組織MTs活性與Pb2+暴露濃度高度正相關，腦組織和肝臟組織MTs可以作為評價該濃度范圍內Pb污染的理想生物標志物。在0.05 mg·L-1Cd2+濃度范圍內，肝臟MDA、鰓組織MTs與Cd2+暴露濃度相關性高，呈現顯著的劑量效應變化(P<0.05)，是水環境中該濃度范圍內Cd污染預警的有效生物標志物。

通過染毒實驗結果對比，可以看出鯽魚體內的毒性代謝機理非常復雜，不同重金屬的暴露實驗，抗氧化防御系統中各酶活性的變化，側面反映蚌湖水質條件下重金屬Pb、Cd對鯽魚肌肉、腦、肝臟、腮組織的氧化損傷。