Crybb2基因敲除對(duì)小鼠晶狀體自噬的影響

高 謙，李建翠，段玉萍，袁想妹，厲 倩

0引言

白內(nèi)障是人類第一位致盲眼病，占所有失明疾病的47.8%。據(jù)估計(jì)，到2025年全球白內(nèi)障失明人數(shù)將達(dá)到4000萬[1]。諸多因素如老化、眼損傷、糖尿病、紫外線照射及某些藥物使用等均可導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生[2-3]，其中老化所引起的年齡相關(guān)性白內(nèi)障占絕大部分。白內(nèi)障的主要特征是晶狀體混濁，晶狀體主要由α、β、γ三類晶狀體蛋白組成，三類晶狀體蛋白對(duì)維持晶狀體的透光性具有重要的作用。β晶狀體蛋白在年輕人晶狀體蛋白中比例約占40%，并隨著年齡增長因其晶狀體修飾變化較大，老年人晶狀體內(nèi)不溶性蛋白比例升高，可能對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障產(chǎn)生具有重要影響[4]。beta-B2晶狀體蛋白(CRYBB2)是β晶狀體蛋白的一種亞組分，與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展關(guān)系極為密切，其基因突變或敲除可以導(dǎo)致白內(nèi)障產(chǎn)生[5-6]，但對(duì)于晶狀體透明性維持確切作用尚不清楚。

自噬是機(jī)體一種依賴于溶酶體水解酶和酸性脂肪酶的吞噬自身細(xì)胞組分(如蛋白質(zhì)聚集體、脂質(zhì)、細(xì)胞器)并對(duì)其進(jìn)行降解的過程。自噬通過去除毒性蛋白質(zhì)聚集物和損傷的細(xì)胞器保護(hù)細(xì)胞，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展恰恰與變性的晶狀體蛋白聚集、損傷纖維細(xì)胞、破壞晶狀體的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。然而，自噬識(shí)別和降解錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白質(zhì)的確切機(jī)制尚未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬與白內(nèi)障形成關(guān)系密切[7-9]，是一種新發(fā)現(xiàn)的重要致病途徑。自噬參與晶狀體細(xì)胞器退化[10]及蛋白質(zhì)降解過程，晶狀體細(xì)胞自噬中斷造成細(xì)胞器和異常蛋白降解缺陷，晶狀體蛋白基因突變或缺失會(huì)影響細(xì)胞自噬功能，導(dǎo)致白內(nèi)障產(chǎn)生。

本課題組于2006年與國外合作單位共同構(gòu)建、順利飼養(yǎng)繁殖Crybb2基因敲除(Crybb2KO)小鼠，并進(jìn)行CRYBB2功能的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)Crybb2KO小鼠在出生6～8周齡時(shí)在皮質(zhì)后部觀察到點(diǎn)狀白內(nèi)障，4mo時(shí)更明顯，6mo時(shí)開始出現(xiàn)點(diǎn)狀皮質(zhì)白內(nèi)障，主要部位在后皮層和前皮層，白內(nèi)障嚴(yán)重程度隨年齡增長而加重；18mo時(shí)整個(gè)晶狀體完全混濁；Crybb2KO小鼠晶狀體重量和軸向直徑明顯小于野生型(WT)小鼠；掃描電鏡顯示6月齡Crybb2KO小鼠晶狀體纖維細(xì)胞排列不規(guī)則，并有突起；WT小鼠晶狀體纖維呈放射狀排列，排列規(guī)則；透射電鏡顯示Crybb2KO小鼠晶狀體細(xì)胞發(fā)生扭曲變形，而WT小鼠晶狀體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則[5]。通過對(duì)CRYBB2、自噬與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究，對(duì)于白內(nèi)障的預(yù)防和治療有重要的作用，可為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組小鼠為Crybb2KO小鼠，由美國iGTL(in Genious Targeting Laboratory)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，并成功在國內(nèi)進(jìn)行繁殖[5]。對(duì)照組小鼠為野生型C57BL/C小鼠，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有小鼠在無病原體的小鼠室中維持12h光照/12h黑暗循環(huán)，隨意自由獲取食物和水喂養(yǎng)。本研究涉及的全部方法均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，同時(shí)獲得了上海市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和儀器兔LC3B多克隆抗體(NB600-1384C，美國Novus Biologicals公司)；兔P62單克隆抗體(abl09012，英國Abcam公司)；兔雷帕霉素靶蛋白(mTOR)多克隆抗體(2983S，美國CST公司)；兔p-mTOR多克隆抗體(5536S，美國CST公司)；兔GAPDH多克隆抗體(ab9485，英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ZB-2301，北京中杉金橋公司)；JEM1230透射電子顯微鏡(日本電子Jeol公司)。

1.2方法

1.2.1透射電子顯微鏡下觀察晶狀體自噬情況分別用6月齡WT和Crybb2KO小鼠各3只，取雙眼晶狀體組織，切取皮質(zhì)層及核心區(qū)分別放入4%戊二醛溶液中固定24h。采用磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)沖洗1%鋨酸后固定，用乙醇梯度脫水，100%丙酮浸透，環(huán)氧樹脂包埋、制片。將鋪于銅網(wǎng)上的切片經(jīng)枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色后，用透射電子顯微鏡觀察兩組小鼠晶狀體皮質(zhì)區(qū)和核區(qū)細(xì)胞器退化情況及自噬小體數(shù)量。

圖1 透射電子顯微鏡檢查(×10000) A：WT小鼠，晶狀體核區(qū)線粒體完全退化；B：Crybb2KO小鼠，晶狀體核區(qū)存在未完全退化線粒體(黑色箭頭)。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)晶狀體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)分別取6月齡WT和Crybb2KO小鼠各3只，雙眼晶狀體組織放入含有蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑中研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000r/min離心20min。取上清，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入加樣緩沖液變性；SDS-PAGE蛋白電泳；通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉，TBST洗3次；5% BSA稀釋一抗(LC3B、P62、mTOR、p-mTOR、GAPDH，1∶2000)，孵育后洗滌；5% BSA稀釋二抗(1∶10000)，孵育后洗滌，Odyssey掃描成像。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影成像，暗室壓片洗片。采用Image J圖像分析軟件分析LC3B、P62、mTOR、p-mTOR表達(dá)的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

圖2 小鼠晶狀體P62和LC3B表達(dá)變化 A：Western blot法檢測(cè)小鼠晶狀體P62的表達(dá)；B：Crybb2KO和WT小鼠晶狀體P62表達(dá)水平比較；C：Western blot法檢測(cè)小鼠晶狀體LC3B的表達(dá)；D：Crybb2KO和WT小鼠晶狀體LC3B表達(dá)水平比較。aP<0.05 vs WT。

2結(jié)果

2.1小鼠晶狀體線粒體形態(tài)變化透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Crybb2KO小鼠晶狀體核區(qū)存在未完全退化的線粒體，線粒體嵴部分?jǐn)嗔?圖1)。

2.2小鼠晶狀體細(xì)胞自噬情況6月齡WT小鼠晶狀體皮質(zhì)區(qū)自噬小體數(shù)量(11.0±0.86AVs/100μm2)少于Crybb2KO小鼠(20.0±2.16AVs/100μm2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.705，P<0.01)。

2.3小鼠晶狀體P62和LC3B表達(dá)變化Crybb2KO小鼠晶狀體組織中P62的表達(dá)(0.64±0.09)顯著高于WT小鼠(0.43±0.07)，LC3B的表達(dá)(0.09±0.01)則顯著低于WT小鼠(0.26±0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.1905、-5.774，均P<0.05，圖2)，表明Crybb2KO小鼠晶狀體細(xì)胞自噬明顯減弱，P62等蛋白出現(xiàn)集聚，提示CRYBB2晶狀體蛋白缺失很可能會(huì)影響晶狀體自噬，從而導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。

圖3 小鼠晶狀體mTOR和p-mTOR表達(dá)變化 A：Western blot法檢測(cè)小鼠晶狀體mTOR和p-mTOR的表達(dá)；B：Crybb2KO和WT小鼠晶狀體mTOR和p-mTOR表達(dá)水平比較，bP<0.01 vs WT。

2.4小鼠晶狀體mTOR和p-mTOR表達(dá)變化采用Western blot法檢測(cè)小鼠晶狀體組織mTOR信號(hào)通路的活化，發(fā)現(xiàn)Crybb2KO小鼠晶狀體組織中p-mTOR的表達(dá)(0.41±0.03)高于WT小鼠(0.27±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.774，P<0.01)，mTOR表達(dá)無差異(圖3)。提示Crybb2KO小鼠晶狀體組織中mTOR存在活化，可能參與了Crybb2KO小鼠晶狀體自噬的抑制。

3討論

晶狀體蛋白占晶狀體水溶性蛋白的90%，是晶狀體的主要組成部分，在維持晶狀體透明度中起關(guān)鍵作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體蛋白缺失或突變會(huì)影響細(xì)胞的自噬功能，使不溶性蛋白的清除受阻，從而導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生[11-13]。aB-R120G和 aA-R49C突變純合子小鼠晶狀體自噬受到抑制，引起晶狀體內(nèi)異常蛋白的降解障礙而集聚，導(dǎo)致遺傳性白內(nèi)障的形成[11-12]。βA3基因敲除小鼠會(huì)產(chǎn)生先天性核性白內(nèi)障，其晶狀體自噬過程被阻斷；該小鼠的晶狀體出現(xiàn)溶酶體清除缺陷，異常蛋白在外皮質(zhì)區(qū)域細(xì)胞核和線粒體積聚，自噬小體增多而積聚；同時(shí)，該小鼠晶狀體細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和鈣蛋白酶-3的表達(dá)和活性均增加。表明晶狀體因缺少βA3晶狀體蛋白或該蛋白的相應(yīng)功能，改變了鈣的穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體功能受損和鈣蛋白酶活化。這些缺陷正是導(dǎo)致βA3基因敲除鼠晶狀體發(fā)生核性白內(nèi)障的主要原因[13]。

Crybb2基因突變易導(dǎo)致先天性白內(nèi)障，突變通常發(fā)生在外顯子6上。突變可使表達(dá)的晶狀體蛋白折疊發(fā)生改變，從而造成晶狀體結(jié)構(gòu)異常，并減弱了其在水溶狀態(tài)下的穩(wěn)定性，進(jìn)而引起晶狀體透明性改變，最終導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生[14-15]。CRYBB2蛋白缺失會(huì)引起皮質(zhì)性白內(nèi)障，本研究對(duì)6月齡WT和Crybb2KO小鼠晶狀體進(jìn)行自噬相關(guān)研究，透射電子顯微鏡結(jié)果顯示Crybb2KO小鼠晶狀體自噬明顯減弱，其晶狀體皮質(zhì)區(qū)自噬小體明顯多于WT小鼠。自噬在晶狀體纖維細(xì)胞成熟，構(gòu)成無細(xì)胞器區(qū)(organell-free zone，OFZ)的過程中起著重要作用。自噬通過降解受損蛋白質(zhì)和線粒體以及通過纖維細(xì)胞成熟過程中線粒體的清除來形成晶狀體的OFZ區(qū)，對(duì)于維持晶狀體穩(wěn)態(tài)非常重要[16]，沒有降解和回收累積的線粒體會(huì)影響晶狀體的狀態(tài)，Crybb2KO小鼠OFZ區(qū)存在未完全退化的線粒體結(jié)構(gòu)，且線粒體累積明顯，其自噬小體的數(shù)目增多可能與其破壞自噬流，增加自噬小體堆積有關(guān)。

自噬形成時(shí)，胞漿型LC3會(huì)酶解掉一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與PE結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ?qū)ψ允审w的形成是非常重要的，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低[13]。Sequestosome-1(SQSTM1)/P62可以被自噬特異性降解，反映蛋白質(zhì)聚集體的積累和自噬激活程度，可以用做自噬被中斷的標(biāo)記[17]，一般用P62聯(lián)合LC3指標(biāo)進(jìn)行自噬流的評(píng)估。本研究發(fā)現(xiàn)WT小鼠晶狀體組織LC3B表達(dá)顯著高于Crybb2KO小鼠，P62表達(dá)低于Crybb2KO小鼠，提示CRYBB2晶狀體蛋白缺失很可能會(huì)影響晶狀體自噬，晶狀體細(xì)胞自噬的減弱或阻斷使不溶性蛋白和細(xì)胞器的清除受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。自噬過程受多種信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控，可分為依賴于或獨(dú)立于哺乳動(dòng)物mTOR通路，mTOR是PI3K/Akt下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可通過激活核糖體激酶，調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)功能；mTOR激活還可顯著抑制自噬的激活[18]。本研究中，Crybb2KO小鼠晶狀體組織p-mTOR表達(dá)顯著高于WT小鼠，提示CRYBB2晶狀體蛋白可能與mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬相關(guān)。

綜上所述，CRYBB2晶狀體蛋白缺失會(huì)影響晶狀體自噬，其機(jī)制可能與mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬相關(guān)。本研究僅檢測(cè)了Crybb2基因缺失后，小鼠晶狀體組織自噬及其相關(guān)蛋白的改變，今后應(yīng)進(jìn)一步研究CRYBB2晶狀體蛋白在自噬相關(guān)的mTOR信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制來明確白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為白內(nèi)障的防治提供理論基礎(chǔ)。