內質網應激在氧化低密度脂蛋白誘導的人RPE細胞凋亡中的作用

吳 桐，黨寬榮，蘇靜波，呂葆真，陸新婷，惠延年，杜紅俊

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是老年人不可逆盲的最主要原因。按照病理變化不同，ARMD可以分為干性和濕性兩種類型。干性ARMD的主要病理改變之一是視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞的凋亡和由此導致的感光細胞死亡，而氧化應激損傷是主要原因[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是近年來發現的一種新的凋亡機制，它通過影響細胞內促存活和促凋亡途徑相關基因的表達，維持細胞內代謝平衡，以及PERK-eLF2-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1和ATF6三種經典的信號途徑發揮作用[2]。既往研究中已證實氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, OxLDL)可引起RPE細胞凋亡，但其參與凋亡的具體機制以及ERS是否參與其中尚不明確[3-4]。本研究采用不同濃度的OxLDL作用于人RPE細胞，觀察對細胞活力和凋亡的影響，同時觀察ERS相關蛋白及凋亡相關酶的變化，探討ERS在OxLDL誘發的人RPE細胞凋亡中的作用和機制。

1材料和方法

1.1材料人RPE細胞系ARPE19(中國科學院細胞庫)、胎牛血清(Hyclone，澳大利亞)、低糖DMEM(Corning，美國)、胰酶(Gibco，美國)、青霉素/鏈霉素(Gibco，美國)、OxLDL、LDL、Dil-OxLDL(翊圣生物，中國)、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒(碧云天，中國)、CCK8(七海生物，中國)、BCA蛋白定量試劑盒、小鼠源Caspase-12抗體、小鼠源β-actin抗體(CST，美國)、兔源CHOP抗體、兔源GRP78抗體、兔源XBP-1抗體、兔源ATF6抗體(Proteintech，中國)、兔源RPE65抗體(Abcam，美國)、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG二抗、辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(翊圣生物，中國)、DAPI(Invitrogen，美國)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，中國)、ECL超敏發光底物(四正柏，中國)。主要儀器設備：CO2培養箱(上海力申科學儀器)、倒置顯微鏡(Olympus，日本)、FSX100熒光顯微鏡(Olympus，日本)、SDS-PAGE 電泳儀、電泳槽及化學發光儀(Bio-Rad，美國)、流式細胞儀(Becton-Dickinson,美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養ARPE19采用低糖DMEM培養基(含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100mg/L鏈霉素)在37°C、5% CO2飽和濕度的培養箱中常規培養。取生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.2.2 RPE細胞吞噬檢測將對數生長期的ARPE19接種于24孔板細胞爬片，常規培養至50%融合狀態后，加入25μg/mL紅色熒光探針Dil標記的OxLDL(Dil-OxLDL)培養8h，4%PFA固定后免疫熒光染色，加入RPE65抗體4℃過夜，洗滌后與Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2h，DAPI染色并封片。使用激光共聚焦顯微鏡觀察RPE細胞吞噬Dil-OxLDL情況并拍照。

1.2.3實驗分組和細胞活力測定將對數生長期的ARPE19接種于96孔細胞培養板，實驗分為(1)對照組：完全培養基常規培養；(2)OxLDL組：完全培養基中加入不同濃度 (5、10、25、50、100μg/mL)OxLDL；(3)LDL組：完全培養基中加入不同濃度(5、10、25、50、100μg/mL)LDL。根據我組前期實驗方法[5]，繼續培養24h后收集細胞，采用CCK8法評價OxLDL對細胞活力的影響。各組細胞活力以其吸光度(optical density, OD)值占正常對照組OD值的百分比表示，公式為：細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%;As:實驗孔吸光度(含細胞、培養基、CCK8溶液和OxLDL/LDL)；Ac:對照孔吸光度(含細胞、培養基、CCK8溶液，不含藥物)；Ab:空白孔吸光度(含培養基、CCK8溶液，不含細胞、藥物)。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡根據文獻報道[6-7]，采用25μg/mL的OxLDL處理人RPE細胞24h后，收集細胞重懸于500μL上樣緩沖液，與Annexin V-FITC 和PI各5μL室溫避光孵育15min，然后采用流式細胞儀(Becton-Dickinson, 美國)分析測定細胞凋亡率。細胞總細胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin V+/PI+)。

圖1 RPE細胞吞噬Dil-OxLDL 細胞免疫熒光染色結果(×200) Merge圖像為共定位；藍色為DAPI染細胞核；綠色熒光為RPE65；紅色熒光為吞噬的Dil-OxLDL。

1.2.5 Western blotting分析根據CCK8實驗結果所選濃度，將細胞分為對照組、OxLDL組(25μg/mL)、LDL組(25μg/mL)。按照本實驗室報道的方法[8]提取蛋白，等量的各組總蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上，經封閉、洗滌后加入一抗小鼠源Caspase-12抗體(1∶1000)、兔源CHOP抗體(1∶1000)、兔源GRP78抗體(1∶1000)、兔源XBP-1抗體(1∶1000)、兔源ATF6抗體(1∶1000)、小鼠源β-actin抗體(1∶1000)，4°C過夜，β-actin作為內參。洗膜后與HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2h。抗原-抗體復合物以ECL發光底物顯示，應用化學發光成像儀(美國Bio-Rad公司，Bio-Rad ChemiDoc XRS+型)采集圖像，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以靶蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值反應靶蛋白相對水平。

統計學分析：采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，數據使用均數±標準差表示。多個樣本均數之間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。雙側檢驗以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 RPE細胞吞噬OxLDL情況激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，細胞RPE65染色陽性，細胞內可見大量吞噬的Dil-OxLDL，證明OxLDL可被RPE吞噬而進入細胞，發揮進一步作用，見圖1。

2.2 CCK8檢測細胞活力結果對照組細胞活力為(100±5.637)%，與對照組比較，OxLDL組經5、10、25、50和100μg/mL處理24h后細胞活力分別為(105.298±9.395)%、(97.106±5.417)%、(77.015±4.055)%、(67.613±3.853)%和(43.872±9.532)%，各組之間比較差異有統計學意義(F=38.45,P<0.05)，與對照組相比，25、50和100μg/mL OxLDL組差異有統計學意義(均P<0.05)，即OxLDL在低濃度(<25μg/mL)時不影響細胞活力，而高濃度時(>25μg/mL)則可降低細胞的活力(P<0.05)。而5、10、25、50和100μg/mL LDL處理24h對細胞活力無影響，差異無統計學意義(P>0.05)，各組細胞活力分別為(97.55±6.217)%、(99.640±3.586)%、(90.495±2.786)%、(83.552±9.171)%和(90.910±1.429)%，見圖2。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡情況因濃度大于25μg/mL的OxLDL會降低細胞活力，因此我們采用25μg/mL處理RPE細胞， Annexin V-FITC/PI染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡水平，結果顯示：對照組、OxLDL組和LDL組凋亡率分別是(5.271±0.519)%、(41.23±1.686)%和(13.07±2.579)%，差異有統計學意義(F=329.8，P<0.01)。且OxLDL組相比LDL組和對照組，以及LDL組相比對照組，差異均有統計學意義(P< 0.05)，見圖3。

圖2 CCK8檢測各組細胞活力。

2.4 Western blotting檢測ERS相關蛋白表達結果對照組、OxLDL組、LDL組5種ERS相關蛋白的表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)。OxLDL組ERS相關蛋白表達均高于對照組和LDL組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖4。

3討論

ARMD是視網膜黃斑區的一種慢性退行性病變，在臨床上主要分為干性(萎縮型)和濕性(滲出或出血型)兩種。其中干性ARMD占確診病例的80%以上，其主要特征是早期玻璃膜疣(drusen)的形成、RPE細胞的變性死亡和由此引起的視網膜外屏障破壞、感光細胞的死亡，進而造成嚴重的視力損傷。而在此過程中，年齡引起的黃斑部的氧化應激起著重要作用[9-11]。隨著RPE細胞的衰老和感光細胞的更新，RPE細胞消化OxLDL的能力降低，過多的OxLDL在RPE細胞內堆積，細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)和非自由基物質增加，最終導致了RPE細胞的死亡[12-13]。臨床試驗已經證明服用抗氧化劑可以減小ARMD進展的風險，這也證明了氧化應激在ARMD發病中的關鍵作用[14-15]。

細胞凋亡是細胞死亡方式的一種程序性，通常和早期疾病的發生密切相關。經典的細胞凋亡通路包括：死亡受體活化(外源性)途徑即細胞表面死亡受體接受胞外死亡信號而激活細胞內的凋亡；線粒體損傷(內源性)途徑即線粒體通過釋放凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等激活Caspase通路導致細胞凋亡。而ERS引起的凋亡是近年來發現的一種新的凋亡方式。內質網是膜相關蛋白和分泌蛋白折疊和組裝的主要細胞內位點。內質網功能障礙可導致蛋白質折疊能力落后于蛋白質折疊負荷。大量錯誤折疊的蛋白質給內質網帶來壓力，進而導致細胞凋亡[16-17]。ERS主要有PERK-eLF2-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1和ATF6三種經典的信號途徑參與，其中后兩個途徑主要調控內質網伴侶蛋白，例如GRP78，從而增加了蛋白質折疊的能力[18]。雖然PERK的早期激活增加了eIF2α的磷酸化，降低了蛋白質翻譯速率，從而使內質網從壓力中恢復。但持續的ERS會激活PERK通路的下游因子CHOP，導致細胞凋亡和死亡[19-20]。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 A：細胞凋亡流式圖；B：細胞凋亡率統計圖；aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs LDL組。

圖4 Western blotting檢測ERS相關蛋白表達結果 A:各組細胞中CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表達結果;B:各組細胞中XBP-1蛋白表達結果;C:各組細胞中ATF6蛋白表達結果。

表1 各組中CHOP、GRP78、Caspase-12、XBP-1和ATF6蛋白表達情況

以往有研究證實OxLDL可通過激活ERK-Bax/Bcl-2信號通路導致RPE細胞凋亡[3]，但ERS是否參與尚未見文獻報道。本研究結果顯示，濃度大于25μg/mL的OxLDL作用于RPE細胞可引起細胞活力降低。進一步通過Annexin V-FITC/PI染色和流式細胞儀檢測發現，OxLDL處理組的RPE細胞凋亡比例增加。 Western blotting檢測結果顯示凋亡相關酶Caspase-12在OxLDL作用下表達增加同時ERS相關蛋白CHOP、GRP78、XBP-1和ATF6表達上調。提示除了經典的凋亡通路，OxLDL還可以通過ERS途徑引起RPE細胞凋亡。

綜上所述，本次研究證實一定濃度OxLDL可通過ERS途徑導致RPE細胞凋亡，而通過調控ERS減少RPE細胞凋亡可能達到控制ARMD進展的目的。