L-叔亮氨酸的合成和應(yīng)用

董凌政 廖詩(shī)雨(西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州 730100)

1 L-叔亮氨酸的性質(zhì)

天然氨基酸和非天然氨基酸之間結(jié)構(gòu)相似但手性不同。L-叔亮氨酸分子式為C6H13NO2，外觀為白色至近乎于白色的粉末狀物質(zhì)，別稱L-2-氨基-3,3-二甲基丁酸，分子量131.17，是一種化學(xué)物質(zhì)。其密度為1.038g/cm3，熔點(diǎn)300℃，沸點(diǎn)217.7℃，閃點(diǎn)85.5℃，折射率-9°，水溶解性125.5g/L(20℃)，蒸汽壓0.0499mmHg (25℃)。圖1為L(zhǎng)-叔亮氨酸的結(jié)構(gòu)式示意圖。

圖1 L-叔亮氨酸的結(jié)構(gòu)式

2 L-叔亮氨酸的功能

L-叔亮氨酸是合成抗病毒藥物阿扎那韋的關(guān)鍵側(cè)鏈。抗癌藥物 BB-2516、抗艾滋病藥物阿扎那韋、抗炎藥物 RO-31-9790、抗丙肝病毒藥物特拉匹韋等藥物的制備都需要借助L-叔亮氨酸進(jìn)行合成。L-叔亮氨酸常常替代其他氨基酸：如纈氨酸、亮氨酸等應(yīng)用于多肽合成中，L-叔亮氨酸用作不對(duì)稱反應(yīng)的催化劑，在用作不對(duì)稱氨化還原反應(yīng)中化學(xué)酶催化劑的配體時(shí)能很好地提升其催化效率。圖2為L(zhǎng)-叔亮氨酸的應(yīng)用示意圖。

3 L-叔亮氨酸的合成

3.1 化學(xué)制備法

3.1.1 有機(jī)拆分

Wittig反應(yīng)是指羰基用磷葉立得變?yōu)橄N，該反應(yīng)又稱為葉立得反應(yīng)或維蒂希反應(yīng)，它主要用于將醛、酮直接合成為烯烴。為了制得L-叔亮氨酸，可以將三甲基乙醛作為反應(yīng)原料，通過(guò)葉立得反應(yīng)，將合成的烯烴經(jīng)過(guò)加成，再在有醋酸鈉-醋酸的條件下發(fā)生取代，經(jīng)過(guò)水解后在催化加氫最常用的Pd/C催化劑作用下即可發(fā)生加成反應(yīng)生成L-叔亮氨酸。該方法反應(yīng)流程如圖3所示。

圖2 L-叔亮氨酸的應(yīng)用

圖3 三甲基乙醛反應(yīng)生成L-叔亮氨酸的流程示意圖

由該反應(yīng)的流程圖可以看出，用此方法制備L-叔亮氨酸步驟繁瑣，且制備過(guò)程中會(huì)有對(duì)環(huán)境造成污染的有機(jī)物參與，隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，目前這種方法已經(jīng)由更為簡(jiǎn)便的其他方法逐漸取代。

3.1.2 有機(jī)合成

手性合成也稱不對(duì)稱合成，是研究向反應(yīng)物引入一個(gè)或多個(gè)具手性元素的化學(xué)反應(yīng)的有機(jī)合成分支。

利用化學(xué)合成方法中的不對(duì)稱合成，將(R)-苯基甘氨酸酰胺或手性α-苯乙胺作為手性誘導(dǎo)劑，分別與特戊醛或叔丁基酮酸經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成L-叔亮氨酸。由于參與此化學(xué)過(guò)程中的催化劑成本高昂，并且會(huì)對(duì)環(huán)境造成較大污染，也不提倡用此法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。該方法反應(yīng)流程如圖4所示。

圖4 不對(duì)稱合成法生成L-叔亮氨酸的流程示意圖

最早用于制備L-叔亮氨酸的方法便是化學(xué)制備法，它的優(yōu)勢(shì)是易擴(kuò)大到工業(yè)水平，但同時(shí)因?yàn)橹苽洳僮鲝?fù)雜、產(chǎn)物產(chǎn)率較低、工藝價(jià)格昂貴、造成環(huán)境污染等諸多問(wèn)題制約了該方法的開(kāi)展和應(yīng)用。

3.2 生物制備法

近年來(lái)，生物制備法逐漸成為制備叔亮氨酸的熱門(mén)研究課題。利用生物法制備L-叔亮氨酸主要分為兩大類，一種是生物催化直接合成法，另一種是生物酶法。

3.2.1 生物催化直接合成法

根據(jù)材料和方式的不同，生物催化可分別使用全細(xì)胞和游離酶作為催化劑制備L-叔亮氨酸。

選用HPLC直接檢測(cè)法作為表征方法，細(xì)菌全細(xì)胞作為催化劑對(duì)以三甲基丙酮酸和甲酸銨為底物的反應(yīng)進(jìn)行催化，將L-叔亮氨酸從三甲基丙酮酸中還原出來(lái)。也可將L-亮氨酸脫氫酶作為催化劑對(duì)以三甲基丙酮酸和甲酸銨為底物的反應(yīng)進(jìn)行催化，從底物甲酸銨中獲取氫原子和氨分子，再在輔酶NADH的作用下將L-叔亮氨酸從三甲基丙酮酸中還原出來(lái)。

3.2.2 生物酶法

生物酶法需要作用的條件溫和，收率、光收率均很高，與化學(xué)合成法不同的是，在利用生物酶法制備目標(biāo)物時(shí)不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和危害，這也是生物酶法最大的優(yōu)勢(shì)。目前在工業(yè)和市場(chǎng)中，生物酶法具有更大的發(fā)展?jié)摿透鼜V闊的發(fā)展空間。

人們首次使用生物酶法制備L-叔亮氨酸時(shí)用到的酶是純化的豬腎酰胺水解酶，但其目標(biāo)物產(chǎn)率很低。赫斯特公司用青霉素G酰化酶輔助一些工藝也合成了L-叔亮氨酸，但其工藝十分復(fù)雜，不便操作。在前人研究的基礎(chǔ)上，后來(lái)還有研究人員探究出一種新的制備方法，即通過(guò)水解酶或者消旋酶對(duì)對(duì)映體進(jìn)行選擇性水解，但因其成本巨大、步驟繁瑣也沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。

α-酮酸成本低廉、容易獲得，且其制備過(guò)程操作簡(jiǎn)單，所以常作為生物酶法的原始底物。由于制備反應(yīng)過(guò)程中輔酶NADH(其結(jié)構(gòu)式如下圖5所示)的成本昂貴，通常在實(shí)驗(yàn)中引入甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶來(lái)解決輔酶再生的問(wèn)題，從而在輔酶NADH的作用下，三甲基丙酮酸能夠高效地從亮氨酸脫氫酶的作用中得到還原。德國(guó)的德固賽公司使用游離的甲酸脫氫酶(FDH)和亮氨酸脫氫酶，在25℃和pH8.0的條件下，利用甲酸脫氫酶將NAD+還原為NADH，從而實(shí)現(xiàn)輔酶的再生，該反應(yīng)最大的優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)現(xiàn)使用酶的回收再利用，其反應(yīng)原理如下圖6所示。美國(guó)一家領(lǐng)先的蛋白質(zhì)工程公司(Codexis)使用游離的酮基還原酶和亮氨酸脫氫酶，在40℃和pH9.0的條件下進(jìn)行了L-叔亮氨酸的合成，游離酮基還原酶的使用也是為了實(shí)現(xiàn)輔酶的再生。

圖5 NADH的結(jié)構(gòu)式

4 結(jié)語(yǔ)

文章介紹了L叔亮氨酸的物化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及應(yīng)用前景，闡述了制備L-叔亮氨酸的各類方法。隨著工業(yè)技術(shù)和科學(xué)研究的發(fā)展，制備L-叔亮氨酸從最初的化學(xué)合成法到現(xiàn)在的生物催化法，實(shí)現(xiàn)了從高成本到低成本，高污染到低污染，高能耗到低能耗的轉(zhuǎn)變。化學(xué)反應(yīng)條件苛刻，步驟繁瑣，需要用到的大量有機(jī)溶劑都需經(jīng)過(guò)多次拆分或多次合成，操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境污染較大的有害物質(zhì)，且收率極低。生物催化法條件溫和，步驟簡(jiǎn)單，產(chǎn)物光學(xué)純度大于99%，收率極高，且不會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境造成污染或危害的物質(zhì)，是一種綠色、環(huán)保的生產(chǎn)工藝。

L-叔亮氨酸作為很多藥物合成的中間體，在生物領(lǐng)域、化工領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域等都具有十分重要的作用，因此對(duì)L-叔亮氨酸合成路線的研究將一直作為熱門(mén)項(xiàng)目，吸引一批又一批的科學(xué)家及研究人員不斷探索、不斷創(chuàng)新。