長江口中華絨螯蟹抱卵前后的標(biāo)準(zhǔn)代謝和窒息點

姬 慧，馮廣朋，莊 平，耿 智，黃曉榮

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200090；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長江口漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，上海 200090）

中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）俗稱河蟹，為我國重要的經(jīng)濟物種之一，長江水系野生中華絨螯蟹具有優(yōu)異的養(yǎng)殖性能和經(jīng)濟價值［1］。野生中華絨螯蟹具有索餌洄游和生殖洄游的習(xí)性，其生活史的不同階段受水域環(huán)境影響較大。天然水域環(huán)境中的氧含量往往影響水生動物的代謝、生長和繁殖，水體嚴(yán)重缺氧時甚至?xí)?dǎo)致水生動物死亡［2］。人類活動增加了水體的營養(yǎng)輸入，改變了沿海水域溶氧的含量，水體夏季缺氧和底層缺氧的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在［3］。墨西哥灣北部海域低氧發(fā)生后，大型底棲動物群落的豐度和物種多樣性降低［4］；在德克薩斯灣的河口水域中，魚類大量死亡的主要原因是由物理和生物因素所引起的溶氧濃度降低［5］。長江口是中華絨螯蟹最主要的天然產(chǎn)卵場，受徑流量和風(fēng)的影響，其缺氧面積在擴大［6］。近幾年來，河口富營養(yǎng)化的程度加劇，造成該水域浮游植物生物量增加，降低了水體的透明度，導(dǎo)致溶解氧含量降低［7－10］。

研究環(huán)境因子對生物體生理代謝影響最常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)代謝［11］。迄今為止，對甲殼類標(biāo)準(zhǔn)代謝的研究主要集中在生物因素（體質(zhì)量、饑餓、攝食、維生素）［12－16］和非生物因素（溫度、鹽度、氧張力、維生素）［17－21］方面。衡量水生動物標(biāo)準(zhǔn)代謝的重要指標(biāo)是耗氧率、排氨率及窒息點［22］。目前對中華絨螯蟹標(biāo)準(zhǔn)代謝的研究較少，迄今僅見中華絨螯蟹成蟹和幼蟹短時間內(nèi)耗氧率和排氨率的研究［23－25］。長江口水體中溶解氧含量的降低是否會對中華絨螯蟹的產(chǎn)卵活動和代謝造成影響仍不清楚，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后對溶解氧的需求也未見相關(guān)報道。因此，本文通過研究長江口中華絨螯蟹抱卵前后的耗氧率、排氨率及窒息點，旨在揭示溶解氧含量與中華絨螯蟹抱卵前后代謝的關(guān)系及其對低氧所承受的閾值，為闡述中華絨螯蟹繁殖期的能量代謝機理及其繁殖生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)資料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的中華絨螯蟹雌蟹采自長江口團結(jié)沙水域（121°57′34″E、31°23′33″N），抱卵前雌蟹和抱卵后雌蟹各30只，其采集時間分別為2018年11月和2019年1月。樣品采集后，運回中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所實驗室暫養(yǎng)。實驗前挑選出體質(zhì)量相似、個體健壯、附肢完整的個體，在水溫為（16±1）℃水族箱中暫養(yǎng)1 d，實驗用水為曝氣48 h以上的自來水，其中抱卵前體質(zhì)量為（46.55±7.57）g、殼寬為（44.51±2.59）mm、殼長為（41.33±1.75）mm；抱卵后體質(zhì)量為（69.40±15.92）g、殼寬為（48.83±3.92）mm、殼長為（41.17±4.07）mm，其中卵塊質(zhì)量為（16.52±3.64）g。

1.2 實驗方法

分別以抱卵前雌蟹和抱卵后雌蟹為實驗對象，設(shè)計2個試驗組。每個試驗組選取18只肢體健全、活性良好的蟹，將其分為3組，作為3個平行實驗，每組6只蟹；實驗開始時，每個試驗組的3次平行同時進行，每次平行實驗需用7個玻璃瓶，其中6個玻璃瓶中每個裝1只蟹，作為代謝瓶，最后1個玻璃瓶不放蟹作為對照瓶。玻璃瓶均采用2 L帶隔板的廣口瓶，瓶內(nèi)插入直徑0.3 cm塑料管道，且管外帶有鐵夾密封；實驗開始時將玻璃瓶放入恒溫水浴箱［（16±1）℃］中，裝滿曝氣去氯3 d以上的自來水，在每個代謝瓶中放入1只蟹，然后用液體石蠟進行液封，再用保鮮膜進行密封。實驗均從上午8∶00開始，每2 h取1次樣，采用50 mL注射器吸取水樣進行相關(guān)指標(biāo)測定，測定指標(biāo)分別為溶氧（DO）和NH3N含量，實驗共持續(xù)12 h。玻璃瓶初始濃度DO為（9.33±0.39）mg·L－1、NH3N為（0.04±0.01）mg·L－1。

溶氧（DO）測定采用溫克勒（Winkler）碘量法（GB 7489 87），用納氏試劑比色法（HJ535 2009）測定氨氮（NH3N）含量［26］。實驗結(jié)束后，測量蟹濕體質(zhì)量、殼長、殼寬等生物學(xué)指標(biāo)。

1.3 耗氧率、NH3 N排泄率、耗氧量和排氨量的計算

中華絨螯蟹雌蟹耗氧率、NH3N排泄率、CO2排泄率、耗氧量和排氨量分別用下列公式計算［24］：

式中，R1為單位體質(zhì)量耗氧率［mg·（g·h）－1］，R2為溶氧量（mg·h－1），C0為實驗開始時代謝瓶中溶氧（mg·L－1），C1為實驗開始時對照瓶溶氧（mg·L－1），C01為實驗結(jié)束時代謝瓶中溶氧（mg·L－1），C11為實驗結(jié)束時對照瓶中溶氧（mg·L－1）。

式中，R3為RNH3 N排出率或者RCO2排出率［mg·（g·h）－1］；R4為排氨量（mg·h－1）。N0為實驗結(jié)束時代謝瓶中NH3N含量（mg·L－1）或者CO2含量（mg·L－1），N01為實驗開始時代謝瓶中NH3N含 量（mg·L－1）或 者CO2含 量（mg·L－1），N1為實驗結(jié)束時對照瓶中NH3N含量（mg·L－1）或者CO2含量（mg·L－1），N11為實驗開始時對照瓶中NH3N含量（mg·L－1）或者CO2含量（mg·L－1）。

V為玻璃瓶中水的體積（L），W為蟹濕體質(zhì)量（g），t為實驗持續(xù)時間（h）。

1.4 氧氮比和能耗率

根據(jù)耗氧率、CO2排出率及NH3N排泄計算其氧氮比和能耗率［27－28］，計算公式如下：

式中，R1為耗氧率［mg·（g·h）－1］；RCO2為CO2排出率［mg·（g·h）－1］；RNH3 N為NH3N排泄率［mg·（g·h）－1］；RE為能量代謝率［J·（g·h）－1］。

1.5 窒息點的檢測

在靜水密閉條件下，（16±1）℃水溫下，隨著代謝瓶中溶氧含量的下降，中華絨螯蟹雌蟹會逐漸死亡。判斷其死亡的標(biāo)準(zhǔn)與三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）［24］基本一致，主要表現(xiàn)為蟹靜臥瓶底不動，兩只螯足掉落，步足僵硬、團臍向上張大等特點，在實驗過程中，若有實驗蟹出現(xiàn)以上特征，認(rèn)定為實驗蟹已死亡，立即抽取一定量水樣，并測定水樣中的溶氧量作為窒息點。分別記錄50%和100%比例的蟹死亡時的溶解氧數(shù)值，作為臨界窒息點［25］和窒息點［29］。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用MSExcel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 18.0軟件的配對樣本T檢驗來檢測中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的窒息點、耗氧率、NH3N排泄率、氧氮比及能耗率的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的窒息點

配對樣本T檢驗結(jié)果顯示，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的窒息點、臨界窒息點和第1只蟹死亡的溶氧濃度值存在顯著性差異（P＜0.05）（表1）。對于窒息點而言，抱卵前窒息點（2.591±0.652）mg·L－1顯 著 大 于 抱 卵 后 窒 息 點（1.101±0.310）mg·L－1（P＜0.05）；對于臨界窒息點而言，抱卵前臨界窒息點（3.432±0.321）mg·L－1顯 著 大于抱卵后（2.161±0.401）mg·L－1（P＜0.05）；對于第1只實驗蟹死亡的溶氧濃度值，抱卵前（3.502±0.431）mg·L－1顯著大于抱卵后（3.001±0.269）mg·L－1（P＜0.05）。

2.2 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的耗氧量和耗氧率

隨著代謝瓶中溶氧含量降低（圖1），發(fā)現(xiàn)在2 h之后代謝瓶中溶氧含量隨時間的變化趨于平穩(wěn)，溶氧與時間的回歸方程分別為抱卵前雌蟹：y＝0.204 3x＋6.036 7（R2＝0.921）和抱卵后雌蟹：y＝0.250 9x＋4.222（R2＝0.965 7）。中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后在12 h內(nèi)耗氧量變化呈下降的趨勢，且變化幅度由大變?。▓D2），在實驗2 h時測定，抱卵后的耗氧量（5.992 mg·h－1）顯著大于抱卵前（3.050 mg·h－1）（P＜0.05）；在實驗開始4 h、6 h、8 h、10 h時測定，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后耗氧量無顯著性差異（P＞0.05），其中在實驗4 h時，抱卵前的耗氧量（1.315 mg·h－1）首次大于抱卵后（0.897 mg·h－1），在實驗6 h時，抱卵前后的耗氧量均達到最小，其值分別為0.149 mg·h－1和0.268 mg·h－1。

隨著代謝瓶中溶氧含量的降低（圖1），中華絨螯蟹抱卵前后的耗氧率均呈下降趨勢，且變化幅度由大變?。▓D3）。配對樣本T檢驗結(jié)果顯示，在實驗2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時測定，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；其中在2 h時測定，抱卵前后耗氧率均達到最高，抱卵后耗氧率0.089 mg·（g·h）－1大于抱卵前0.066 mg·（g·h）－1；在實驗4 h時測定，抱卵前耗氧率0.030 mg·（g·h）－1首次大于抱卵后0.015 mg·（g·h）－1；在實驗6 h時測定，抱卵前后的耗氧率均降到最低，其值分別為0.003 mg·（g·h）－1和0.004 mg·（g·h）－1。

表1 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的窒息點變化（n＝18）Tab.1 Changes of asphyxiation point of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis（n＝18）

圖1 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后代謝瓶溶氧的變化Fig.1 Changes of dissolved oxygen（DO）concentration in water with metabolism of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

圖2 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后耗氧量的變化Fig.2 Changes of oxygen consum ption of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

圖3 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后耗氧率的變化Fig.3 Changes of oxygen consumption rate of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

2.3 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的排氨量和排氨率

在12 h內(nèi)中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后代謝瓶中氨氮含量變化呈上升的趨勢（圖4），隨著代謝瓶中溶氧含量的降低，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后排氨量呈現(xiàn)出“下降－上升”的趨勢（圖5）。在實驗2 h、4 h、6 h時測定，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后排氨量差異不顯著（P＞0.05），其中在實驗2 h時測定，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后排氨量最高，抱卵后排氨量（1.379 mg·h－1）大于抱卵前（1.194 mg·h－1）；在4 h時，抱卵前排氨量（0.433 mg·h－1）首 次 大 于 抱 卵 后（0.357 mg·h－1）；在實驗6 h時測定，抱卵前和抱卵后排氨量達到最低，其值分別為0.109 mg·h－1和0.096 mg·h－1，繼6 h降到最低值后，抱卵前后分別在8 h時，排氨量再次升高，其值分別為0.464 mg·h－1和0.206 mg·h－1。

圖4 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后代謝瓶氨氮量的變化Fig.4 Changes of dissolved ammonia concentration in water w ith metabolism of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

圖5 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后排氨量的變化Fig.5 Changes of ammonia discharge of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

抱卵前后中華絨螯蟹排氨率隨代謝瓶中溶氧含量的降低呈現(xiàn)“下降－上升”的趨勢（圖6）。在實驗開始2 h、4 h、6 h、8 h時，抱卵前的排氨率均大于抱卵后，且相互間差異不顯著（P＞0.05）；在實驗2 h時測定，抱卵前和抱卵后的排氨率達到最大，其值分別為0.027 mg·（g·h）－1和0.020 mg·（g·h）－1；在實驗6 h時，抱卵前和抱卵后的排氨率達到最低，其值分別為0.002 mg·（g·h）－1和0.001 mg·（g·h）－1；在實驗10 h時，抱卵后的排氨率0.011mg·（g·h）－1顯著大于抱卵前0.003 mg·（g·h）－1（P＜0.05）。

圖6 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后排氨率的變化Fig.6 Changes of ammonia excretion rate of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

2.4 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的氧氮比和能耗率

隨著代謝瓶中溶氧含量的降低（圖1），在4 h之后，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后氧氮比和能耗率均呈下降趨勢（表2）。配對樣本T檢驗得出，對于氧氮比而言，在實驗2 h、4 h、6 h時測定，抱卵前和抱卵后的氧氮比均無顯著差異性（P＞0.05）；其中在2 h時測定，抱卵后的氧氮比（4.287±1.741）大于抱卵前（3.042±0.803）；在實驗4 h時測定，抱卵前的氧氮比均大于抱卵后。對于能耗率而言，在實驗2 h時，抱卵后的能耗率（1.07±0.11）大于抱卵前（0.62±0.03），且相互間無顯著性差異（P＞0.05）；在實驗4 h時測定，抱卵前的能耗率大于抱卵后。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹抱卵前后的窒息點變化

水生生物自身的生理反應(yīng)受所處環(huán)境中溶氧含量的影響，不同水生生物有不同的臨界氧濃度，當(dāng)其所處水域的溶氧瞬間下降或遠小于臨界氧濃度時，若其不能夠躲避低溶氧環(huán)境，將對自身造成生理和生化上的影響，嚴(yán)重可致死亡。窒息點能夠直接反映水生生物存活的最低溶氧值，并且是衡量水生生物對低氧耐受力的重要參數(shù)［30］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹抱卵前的窒息點（2.591±0.652）mg·L－1顯著大于抱卵后（1.101±0.310）mg·L－1，推測原因之一是，在自然條件下中華絨螯蟹抱卵后由于腹部抱卵，行為活動遲緩，一般半埋在沙子和淤泥中，活動和攝食很少［31］，通過降低代謝活動以逐漸適應(yīng)低氧環(huán)境，對低氧的敏感性弱；原因之二是窒息點與體質(zhì)量的關(guān)系存在兩種類型，一種是窒息點隨體質(zhì)量的升高而降低，另一種是窒息點隨體質(zhì)量的升高而升高［32］，本實驗中抱卵前體質(zhì)量（46.55±7.57）g小于抱卵后（69.40±15.92）g，報卵前后窒息點的差異可能是受其體質(zhì)量的影響，這與李朝華等［24］研究三疣梭子蟹（Ⅹ～Ⅺ期）的結(jié)果一致。

表2 中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的氧氮比和能耗率Tab.2 Oxygen nitrogen ratio and energy consumption ratio of female non ovigerous and ovigerous Eriocheir sinensis

3.2 溶氧對中華絨螯蟹抱卵前后雌蟹代謝的影響

耗氧率和氨氮排泄率是反映水生動物標(biāo)準(zhǔn)代謝高低和變化規(guī)律的重要指標(biāo)［22］。水體中溶氧（DO）含量充足時，水生生物自身的耗氧率和排氨率也會相應(yīng)增高，反之，水體中DO含量較低時，機體的耗氧率和排氨率隨DO含量的降低而降低［11］。本研究中，隨著代謝瓶中溶氧的降低，抱卵前后的耗氧量與耗氧率、排氨量與排氨率均呈現(xiàn)下降趨勢，說明低氧降低了中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的代謝，這與低氧條件下中華絨螯蟹仔蟹［28］、齊口裂腹魚（Schizothoraxprenanti）［33］和中華鰟鮍（Rhodeussinensis）［34］等代謝機制一致。研究表明［35］，水生動物對低氧的調(diào)節(jié)能力與個體大小相關(guān)，一般情況下個體大的對低氧的調(diào)節(jié)能力強，且對低氧的耐受力強。本研究中，實驗進行2 h時，抱卵后的耗氧率、排氨量和耗氧量均高于抱卵前，隨著代謝瓶中溶氧含量進一步降低，抱卵后的耗氧率和排氨率逐漸低于抱卵前，這可能由于在低氧條件下，蟹通過提高顎舟片拍打頻率來適應(yīng)低氧環(huán)境，這種提高呼吸頻率的方式是需要耗能的，因此個體大的有更多的能量去調(diào)節(jié)呼吸頻率，用于抵抗低氧環(huán)境，這與李麗萍等［36］研究的背角無齒蚌（Anodontawoodiana）的結(jié)果一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，隨著代謝瓶中溶氧含量的降低，2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時，抱卵前和抱卵后的耗氧率和排氨率無顯著差異，說明在低氧條件下，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后單位體質(zhì)量的代謝率無顯著差異。

機體分解體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等能源物質(zhì)時所消耗的氧氣和排泄氨之間的比率稱為氧氮比（O∶N），是衡量機體能量代謝的一項重要指標(biāo)，揭示了機體能量來源的組成及能量代謝的路徑［37］。甲殼動物分解的含氮終產(chǎn)物主要以氨氮形式排放，因此氨氮排泄率可作為體內(nèi)蛋白質(zhì)分解速率的指標(biāo)之一。從理論上講，純蛋白分解代謝，其氧氮比為3～16；若蛋白質(zhì)和脂質(zhì)同等代謝比例時，其氧氮比為50～60；若脂類和碳水化合物代謝時，其氧氮比逐漸增大，氧氮比越低則代表能量代謝底物中蛋白質(zhì)比例越大。本研究中，抱卵前后氧氮比隨溶氧含量的降低，其比值趨向小于16的方向，說明低氧促進長江口中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后以蛋白質(zhì)為代謝底物方向轉(zhuǎn)變，這與三疣梭子蟹［38］及黃金鱸（Percaflavescens）［39］的主要代謝能源物質(zhì)一致。在8 h、10 h和12 h時，抱卵后的氧氮比顯著低于抱卵前，推測可能是因為中華絨螯蟹抱卵后在水中完成胚胎發(fā)育時，更傾向于利用蛋白質(zhì)作為能源代謝物質(zhì)［40］。

4 小結(jié)

本實驗表明低溶氧降低了長江口中華絨螯蟹雌蟹抱卵前和抱卵后的代謝水平；低溶氧條件下，雌蟹抱卵前和抱卵后單位體質(zhì)量的代謝率無顯著變化；長江口中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的能源代謝底物中蛋白質(zhì)含量隨溶氧含量的降低而升高。本研究結(jié)果揭示了在溶氧含量降低的條件下，中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后標(biāo)準(zhǔn)代謝特征以及對低氧所承受的閾值，有助于進一步闡明中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的代謝機理，豐富其繁殖生物學(xué)知識。