紫薯花色苷果膠/海藻酸鈣復(fù)合凝膠球的制備及性能研究

陳芳，張悅，唐靜，李俊杰

(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

花色苷是一類(lèi)廣泛存在于果蔬花草等高等植物中的化合物，一些發(fā)達(dá)國(guó)家已將其開(kāi)發(fā)為藥品和保健食品[1]。紫薯花色苷是從紫薯中提取出的一種花色苷，具有降血壓、降血脂、抗氧化、防突變、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和預(yù)防心血管疾病等功效[2]。但由于其母核連有許多羥基，易受環(huán)境中氧、熱、pH、光等影響導(dǎo)致分子異構(gòu)、聚合和降解，從而導(dǎo)致天然花色苷易降解褪色[3]。因此，如何提高花色苷的穩(wěn)定性，提高人體吸收率，一直備受關(guān)注。

為了提高紫薯花色苷的生物利用率，本實(shí)驗(yàn)制備了海藻酸鈉與果膠的天然復(fù)合鈣凝膠珠，去包埋紫薯花色苷，并分析果膠與海藻酸鈉的濃度比例、氯化鈣溶液濃度、交聯(lián)時(shí)間對(duì)凝膠珠質(zhì)地、對(duì)紫薯花色苷的包埋率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

橘皮果膠(APC230，酯化度35)，由煙臺(tái)安德利果膠有限公司提供；紫薯花色苷(純度10%)，由陜西森朗生物化工有限公司提供；海藻酸鈉(食用級(jí))，由青島明月海藻集團(tuán)有限公司提供；氯化鈣(食品級(jí))，由浙江一諾生物科技有限公司提供；氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙醇等均為分析純。

TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀；UV1102Ⅱ型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；900-CN pH計(jì)；T09-1S恒溫磁力攪拌器；HJ-6A多頭磁力攪拌器；ZWY-110X30型恒溫培養(yǎng)振蕩箱；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)；XKA-2200臺(tái)式低速離心機(jī)；SU8020掃描電子顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯花色苷橘皮果膠鈣凝膠球的制備 按照一定比例分別稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的樣品，溶于30 mL蒸餾水中，并在恒溫磁力攪拌器上攪拌30 min(1 000 r/min、20 ℃)，將混合均勻的溶液離心(4 000 r/min、10 min)，以去除溶液表面氣泡，然后移入注射器(20 mL)中，備用。將膠體溶液室溫滴入不同濃度的氯化鈣溶液中攪拌，移出在去離子水中攪拌4 min以清洗凝膠珠，于室溫下培養(yǎng)皿中保存。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在果膠1.5 g，白砂糖2.7 g，紫薯花色苷0.075 g，去離子水30 mL時(shí)，選取變量膠凝時(shí)間(1，2，3，4，5 min)、果膠與海藻酸鈉比例(4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1)、氯化鈣溶液濃度(1%，3%，6%，9%，12%)3個(gè)可能影響凝膠珠質(zhì)構(gòu)和包封率的因素，按照1.2.1節(jié)方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)以確定各單因素的適宜范圍。

1.2.3 果膠鈣凝膠球制備條件優(yōu)化 采用正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)果膠鈣凝膠球制備條件進(jìn)行優(yōu)化，其因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 質(zhì)構(gòu)分析 使用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)凝膠珠進(jìn)行TPA質(zhì)地測(cè)定，采用直徑35 mm圓柱形探頭P36R，測(cè)試條件確定如下：預(yù)測(cè)試速度1.0 mm/s，測(cè)試速度和測(cè)后速度均為0.5 mm/s，目標(biāo)模式是strain，凝膠珠的壓縮量為30%，使用觸發(fā)力為0.05 N的Auto(Force)觸發(fā)型，皮重模式為Auto。每項(xiàng)測(cè)試重復(fù)3次，取硬度和彈性數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，選取最優(yōu)組。

1.2.5 紫薯花色苷橘皮果膠鈣凝膠球載藥量及包封率的測(cè)定

1.2.5.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱(chēng)取0.1 g樣品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，制成 1 mg/mL 溶液。然后分別取出2，4，6，8，10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至10 mL。利用紫外分光光度計(jì)，在527 nm下測(cè)量5種不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL)溶液的吸光度值，并以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪成曲線。

圖1 紫薯花色苷標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線Fig.1 The calibration curve of purple sweet potato anthocyanin

由圖1可知，紫薯花色苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.743x-0.073(r=0.996)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，紫薯花色苷濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.5.2 樣品中紫薯花色苷的測(cè)定 從烘箱中取出干燥后的樣品，用研缽做粗略粉碎后稱(chēng)取1 g樣品于100 mL錐形瓶中。用移液管移取25 mL甲醇于錐形瓶。之后用分散儀進(jìn)行進(jìn)一步粉碎，直至小顆粒變?yōu)榧?xì)微的粉末。將錐形瓶瓶口用橡膠塞密封，防止甲醇揮發(fā)。將錐形瓶放置在陰涼避光的場(chǎng)所提取24 h。將提取液于4 000 rad/min下離心 10 min。移取上清液于比色皿中。以甲醇為空白對(duì)照，將紫色分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)置為527 nm，測(cè)定樣品溶液對(duì)應(yīng)吸光度值[4]。

1.2.6 溶脹性能研究 干燥的凝膠珠溶脹性通過(guò)在緩沖液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體方法為：精密稱(chēng)取干燥后的凝膠珠，分別放在裝有25 mL緩沖溶液(pH分別為：4.0，7.0，9.0)的帶蓋培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫水浴，然后間接性的(每過(guò)1 h)將凝膠珠取出并且用濾紙吸干其表面的水分并在電子天平上稱(chēng)重[5]。溶脹系數(shù)通過(guò)以下公式計(jì)算：

ESR=(WEs-Wd)/Wd

溶脹比為：SR= (WS-Wd)/Wd

其中，ESR為平衡溶脹比；WEs為水凝膠達(dá)到平衡溶脹時(shí)的質(zhì)量；SR為溶脹比；WS為水凝膠不同時(shí)間段的溶脹質(zhì)量；Wd為凝膠珠干燥質(zhì)量。

1.2.7 體外緩釋 模擬胃液：KCl(1.12 g/L)，NaCl(2.0 g/L)，CaCl2(0.11 g/L)，KH2PO4(0.4 g/L)，用鹽酸將 pH 調(diào)整為
1.2。模擬腸液就用碳酸氫鈉將上述溶液pH調(diào)整至6.8。模擬結(jié)腸液就在腸液中用碳酸氫鈉將pH調(diào)為7.4并加入果膠酶。取新鮮制備的凝膠珠，加入到100 mL裝有模擬胃液的錐形瓶中，錐形瓶放置在恒溫振蕩箱中(150 r/min，37 ℃)2 h，其中每隔30 min用紫外分光光度計(jì)檢查紫薯花色苷的含量。然后重新收集凝膠珠轉(zhuǎn)移到模擬腸液中，每隔 30 min 檢測(cè)溶液中紫薯花色苷的含量。直到2 h 后，轉(zhuǎn)移至模擬結(jié)腸液中，每隔 30 min檢測(cè)紫薯花色苷的含量[6]。

1.2.8 掃描電鏡 利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察凝膠球的表面形貌。將冷凍干燥的樣品粘到導(dǎo)電膠上，在真空下噴金，加速電壓設(shè)置為10.0 kV，分別在35倍和100倍下對(duì)凝膠球的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)和剖面形態(tài)進(jìn)行觀察。剖面的制作是將樣品放置于液氮中，用刀子切面即可。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響

微膠囊的功能性與其化學(xué)與機(jī)械穩(wěn)定性密切相關(guān)。若微球容易變形，則微膠囊就比較容易受到破壞造成包容物被提前釋放。不同果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響見(jiàn)表2。

表2 果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響Table 2 Effect of mass ratio of pectin/alginate on the mechanical properties of gel beads

由表2可知，隨著果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比的增大，凝膠珠的硬度呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，而彈性卻無(wú)顯著性變化。這是因?yàn)楹Ｔ逅徕c的黏性比果膠大，因此當(dāng)凝膠珠中海藻酸鈉較大時(shí)，凝膠珠間粘性變大，硬度降低，而隨著果膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比例增大至7∶1時(shí)，凝膠珠的黏性減小，脆性和硬度增大。梁嬌旸之前的研究也顯示相同體積分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液黏度較果膠溶液黏度要大[7]。Bekhit的研究顯示，海藻酸鈉與果膠的復(fù)合物比單純的果膠和海藻酸鈉更能增強(qiáng)凝膠珠的機(jī)械性能，凝膠珠更硬，這是由于果膠和海藻酸鈉的協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致，另外從分子建模來(lái)看，海藻酸鈉的G區(qū)域和甲氧基化的半乳糖醛酸帶可在平行的雙晶陣列中相互組合[8]。另外，由表可知，包封率隨著果膠的增加而增加，但隨著海藻酸鈉的比例減少，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得稀疏，當(dāng)果膠與海藻酸鈉的比例為8∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大，而后開(kāi)始減少。

2.2 氯化鈣濃度對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響

氯化鈣濃度對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響見(jiàn)表3。

表3 氯化鈣濃度對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響Table 3 Effects of calcium chloride concentration on mechanical properties of gel beads

由表3可知，隨著氯化鈣濃度的增大，凝膠珠的硬度不斷增大，彈性則逐漸減小至最低然后保持不變。這是因?yàn)椋S著氯化鈣濃度的增大，有利于果膠與海藻酸之間的交聯(lián)，使凝膠網(wǎng)絡(luò)形成更致密，導(dǎo)致凝膠珠硬度增大。但隨著氯化鈣的濃度繼續(xù)增大，過(guò)量的Ca2+則導(dǎo)致果膠與海藻酸鈉聚集形成沉淀，或成為不溶性的鹽類(lèi)物質(zhì)，并產(chǎn)生苦味，導(dǎo)致凝膠珠的口感質(zhì)地變差。此結(jié)果與孔靜等的研究一致[9]。另外，凝膠球的包封率隨著氯化鈣濃度的增加呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，這可能由于，隨著氯化鈣的濃度的增大，交聯(lián)充分，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，使得更多的紫薯花色苷被緊緊固定在凝膠球內(nèi)，這與劉敏的研究結(jié)果相似[10]。

2.3 膠凝時(shí)間對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響

膠凝時(shí)間對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響見(jiàn)表4。

表4 膠凝時(shí)間對(duì)凝膠珠機(jī)械性能的影響Table 4 Effect of gelation time on mechanical properties of gel beads

由表4可知，隨著膠凝時(shí)間的增加，凝膠珠的硬度呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，彈性則顯著性降低，這是因?yàn)椋捎跁r(shí)間的增大，使得果膠、海藻酸鈉與鈣離子之間進(jìn)行充分的交聯(lián)，使得凝膠珠變得更加的致密，從而導(dǎo)致凝膠珠的硬度增大，而彈性降低，由表4還可知，當(dāng)膠凝時(shí)間從4 min增大到5 min時(shí)凝膠珠的硬度出現(xiàn)明顯的增大趨勢(shì)，而彈性無(wú)顯著性變化。

2.4 果膠鈣凝膠球制備條件的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)，選取果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比、氯化鈣濃度與凝膠珠膠凝時(shí)間，以形成的凝膠珠的硬度、彈性、對(duì)紫薯花色苷的包封率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定制備凝膠珠的最優(yōu)條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of orthogonal experiment

由表5可知，對(duì)紫薯花色苷包埋率最大的為第6組，機(jī)械性能較好的也為第6組實(shí)驗(yàn)制備的凝膠珠，這也與之前的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。彈性最大組為第1組，但此時(shí)硬度過(guò)低，果膠凝膠珠容易變形易破裂。由表5還可知，各因素中對(duì)凝膠珠硬度影響最大的為果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比，對(duì)彈性和包封率兩個(gè)指標(biāo)影響最大為氯化鈣濃度。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可得出，當(dāng)硬度和包封率最佳時(shí)的水平組合為果膠/海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶1，氯化鈣濃度為9%，膠凝時(shí)間為5 min。由pearson函數(shù)分析，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的硬度和包封率相關(guān)系數(shù)為0.70為強(qiáng)正相關(guān)。即硬度越大，對(duì)紫薯花色苷的包封率就越大，由彈性數(shù)據(jù)可知，除了第1組、第8組彈性值明顯高于其他組外，其他組的彈性并無(wú)顯著性差異。以正交最佳水平做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出凝膠珠包封率為
1.10 mg/mL，遠(yuǎn)高于最高的第6組(7∶1、5 min、3%)，因?yàn)樽顑?yōu)組氯化鈣濃度高于第6組，所測(cè)結(jié)果符合單因素實(shí)驗(yàn)所得規(guī)律。

2.5 溶脹性能實(shí)驗(yàn)

凝膠球的溶脹性能是應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域時(shí)需要衡量的重要因素之一。溶液環(huán)境會(huì)大大影響凝膠球的溶脹性能。本實(shí)驗(yàn)考察了凝膠球在不同pH溶液介質(zhì)中的溶脹情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同介質(zhì)中凝膠球的溶脹率Fig.2 The swelling ratio of beads in different mediums

由圖2可知，凝膠球在溶液中溶脹前后直徑均有明顯變化，其中，在酸性和中性溶液中的溶脹比大致相同，在堿性溶液中的溶脹比大于在酸性和中性溶液中的溶脹比。在酸性和中性溶液中溶脹后的凝膠球還保持有一定彈性和硬度，在堿性溶液中的凝膠球溶脹后出現(xiàn)破碎脫落現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樵谒嵝匀芤褐袔щ姾傻聂然鶖?shù)量較少，分子間斥力較低，而在堿性溶液中大量羧基基團(tuán)被離子化，形成 —COO-，這些陰離子間產(chǎn)生靜電排斥力，大量水分子進(jìn)入凝膠體系中，使得凝膠球溶脹比增大，且果膠在堿性溶液中會(huì)發(fā)生皂化反應(yīng)而被脫脂化[5，11-12]，從而產(chǎn)生破碎脫落現(xiàn)象。

2.6 體外緩釋實(shí)驗(yàn)

就紫薯花色苷從凝膠球中的釋放，本文模擬了胃腸道進(jìn)行釋放研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 凝膠球在模擬體外緩釋中紫薯花色苷的累積釋放率Fig.3 Cumulative release rate of anthocyanins from purple potato in simulated slow release in vitro

由圖3可知，紫薯花色苷在胃液中累積釋放量為25.02%，在腸液中累積釋放量達(dá)到34.5%，在結(jié)腸液中大量釋放，累積釋放量為54.8%，由于模擬時(shí)間有限，可以看出凝膠球在5 h時(shí)，還未完全降解。在模擬胃液中，由于凝膠球具有多孔結(jié)構(gòu)，凝膠球此時(shí)溶脹較弱也有部分紫薯花色苷釋放出來(lái)，而在腸液和結(jié)腸液中，由于凝膠球的進(jìn)一步溶脹和果膠酶的存在更加速了紫薯花色苷的釋放[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的海藻酸鈉與果膠的天然復(fù)合鈣凝膠珠能將紫薯花色苷定向輸送至腸道，從而提高了人體對(duì)其吸收利用率。

2.7 凝膠球表面和超微結(jié)構(gòu)比較

肉眼觀察濕態(tài)凝膠球，其直徑在0.5～0.7 cm，表面光滑，呈紫紅色半透明狀態(tài)。烘干后凝膠球?yàn)楸馄降臋E圓球狀，表面光滑，呈深紅色。凍干后的凝膠球?yàn)闄E圓球狀，表面有皺縮，呈紅色。

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 凝膠球在不同狀態(tài)下的表征形態(tài)Fig.4 Characterization of gel spheres in different states A.濕態(tài)凝膠球；B.凍干凝膠球表面(100×)；C.凍干凝膠球切面(35×)

由圖4可知，凍干后，凝膠球體積發(fā)生明顯變化，表面粗糙并產(chǎn)生褶皺，整體為橢球形。半球切面顯示，凝膠球外殼結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)核有很多空洞結(jié)構(gòu)，該結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制作的凝膠球結(jié)構(gòu)能用于對(duì)紫薯花色苷的包埋。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備了海藻酸鈉與果膠的復(fù)合鈣凝膠球并用于對(duì)紫薯花色苷的包埋，運(yùn)用單因素及正交實(shí)驗(yàn)分析方法探討了果膠與海藻酸鈉比例、氯化鈣濃度、膠凝時(shí)間對(duì)海藻酸鈉-果膠鈣凝膠球的機(jī)械性能及對(duì)紫薯花色苷包埋率的影響。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著果膠與海藻酸鈉比例的增大、氯化鈣濃度的增大，凝膠球的硬度增大，彈性則沒(méi)有顯著性差異，膠凝時(shí)間的延長(zhǎng)使凝膠球的硬度增加，彈性顯著性降低，評(píng)價(jià)指標(biāo)中硬度與包封率為強(qiáng)正相關(guān)。采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化果膠-海藻酸鈉凝膠球形成的條件，得出最優(yōu)組：果膠與海藻酸鈉比例為7∶1，氯化鈣濃度9%，膠凝時(shí)間5 min。此時(shí)凝膠球硬度最大、包封率最高1.10 mg/mL。將荷載紫薯花色苷的果膠-海藻酸鈉復(fù)合鈣凝膠球進(jìn)行溶脹、體外緩釋、SEM實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明凝膠球形成的殼核結(jié)構(gòu)能將紫薯花色苷包埋于其中，且能定向輸送至腸道進(jìn)行人體的吸收，可有效避免胃液對(duì)紫薯花色苷的消化降解，提高了紫薯花色苷在人體中的生物利用率。