乙醇-硫酸銨雙水相萃取柚子皮中黃酮類化合物的研究

韓秋菊，王晨，李薇，李曉楠

(遼寧石油化工大學 化學化工與環境學部，遼寧 撫順 113001)

柚子為蕓香科植物柚的成熟果實。成熟的柚子味道酸甜、涼潤，營養價值和藥用價值都很高，是最具食療功效的水果之一。柚子皮可用于清熱去火，去油解膩，也可醒酒、助消化。柚子皮中的黃酮類物質包括柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、蕓香苷等，具有抗炎、抗病毒、鎮痛、降血壓的作用，能降低血液中的膽固醇，減少血栓的形成，可用于預防和治療心腦血管類疾病[1-3]。柚子皮既厚且大，占柚子重量的20%～30%，又富含黃酮類化合物，是提取黃酮類物質的理想原料。本研究利用雙水相萃取法從柚子皮中萃取黃酮類化合物，為更充分地開發利用柚子資源提供依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

柚子皮(新鮮沙田柚果皮)；蘆丁標準品、硫酸銨、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

HH-4數顯恒溫水浴鍋；FW100高速萬能粉碎機；AR522CN電子天平；721s可見光分光光度計；HZQ-C恒溫振蕩培養器。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 柚子皮用蒸餾水反復沖洗后，切成1～2 cm2的小塊，50 ℃干燥箱中干燥72 h，粉碎機粉碎。

1.2.2 柚子皮中黃酮類化合物的萃取 稱取適量乙醇、硫酸銨配制萃取劑，加入25 mL的比色管中，按照液料比35∶1準確稱取適量的柚子皮粉末，在 40 ℃ 下振蕩萃取1.5 h。分別測定上下相液體的體積和黃酮含量，經由公式(1)～(4)可求得雙水相的總黃酮萃取率及得率。

R=Vt/Vb

(1)

其中，R為相比；Vt和Vb為體系上、下相的體積。

K=Ct/Cb

(2)

其中，K為黃酮分配系數，Ct和Cb為上、下相的黃酮質量濃度。

X=1/[1+1/(R×K)]×100%

(3)

其中，X為黃酮萃取率，%。

Y=Ct×Vt×n/m

(4)

其中，Y為黃酮得率，mg/g，Ct為上相黃酮濃度；Vt為上相萃取液的體積；m為柚子皮樣品質量；n為稀釋倍數。

1.3 蘆丁標準曲線的繪制

稱取蘆丁標準品10 mg，用50%的乙醇溶解，定容至50 mL，制備0.2 mg/L的蘆丁標準溶液。分別將0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL的蘆丁標準溶液加入25 mL比色管中，加入30%的乙醇定容至 10 mL。加入1 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min。加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min。最后加入10%的氫氧化鈉溶液10 mL，用30%的乙醇定容至25 mL，靜置15 min。510 nm處測定各組溶液吸光度值，繪制蘆丁標準曲線，回歸出線性方程y=0.553 4x-0.001 6，R2=0.999 5。

2 結果與討論

2.1 雙水相萃取柚子皮中黃酮類化合物最佳萃取體系的確立

液料比、萃取時間、萃取溫度不變，分別考察硫酸銨和乙醇質量分數對柚子皮中黃酮類化合物萃取效果的影響，結果見圖1、圖2。

圖1 硫酸銨質量分數對柚子皮黃酮得率、 萃取率和分配系數的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

由圖1可知，柚子皮中黃酮類化合物得率在硫酸銨的質量分數為30%的時候最大。萃取率和黃酮分配系數均隨著硫酸銨質量分數的增加而增加。

由圖2可知，柚子皮中黃酮類化合物得率在乙醇質量分數為35%的時候最高，隨著乙醇質量分數增加，萃取率和黃酮分配系數均出現先增加后下降的趨勢。在后續實驗中雙水相體系乙醇的質量分數選取35%，硫酸銨的質量分數選取30%。

圖2 乙醇質量分數對柚子皮黃酮得率、 萃取率和分配系數的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

2.2 單因素實驗

分別考察萃取溫度、時間、液料比對黃酮得率的影響。結果顯示，最佳萃取溫度為40 ℃，最佳萃取時間為1.5 h，最佳液料比為35∶1。

圖3 單因素實驗考察柚子皮黃酮的萃取條件Fig.3 Study of grapefruit peel flavonoids extraction conditions by single factor experiments

2.3 響應面實驗優化雙水相體系的萃取條件

2.3.1 響應面實驗結果 依據單因素實驗的結果設計響應面實驗，以柚子皮中總黃酮得率為評價指標，優化萃取工藝條件。因素與水平見表1，結果見表2。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應面實驗結果Table 2 The results of response surface experiment

2.3.2 響應面實驗分析 實驗數據回歸擬合以后，響應值與測試變量之間的關系可以用以下多元二次回歸方程來描述：

Y=44.39+5.61A+4.08B-2.99C-2.66AB+4.18AC+1.26BC-0.73A2-3.39B2-3.59C2

回歸模型方差結果分析見表3。

表3 回歸方程模型方差Table 3 Variance of regression equation model

由表3可知，模型P為0.003 3<0.01，極顯著。模型R2=0.926 5，說明模型與實際實驗擬合情況良好。失擬項P值是0.245 3>0.05，不顯著，表示方程擬合不足檢驗不顯著，變化系數值7.35%，顯示出很高的精密度等級和實驗值很高的可靠性。實驗考察的3個因素P值均<0.05，影響均顯著，各因素影響由強到弱依次為：萃取溫度>萃取時間>液料比。各個實驗因素對其響應值的影響不是簡單的線性關系，交互項中AC的影響顯著(P值是0.019 2<0.05)。

2.3.3 響應面圖解析 等高線圖和3D響應面圖表示各影響因素中任意一個變量取零時，其余兩個因素對黃酮得率的影響。

由圖4可知，柚子皮黃酮得率隨萃取溫度的上升呈現先增后降的趨勢，近50 ℃時萃取的總黃酮量最高。黃酮得率隨著萃取時間延長呈現先增后減的變化趨勢，萃取時間1.6 h時，黃酮類化合物的得率達到了最大值。黃酮得率隨液料比增大呈現先增后減的趨勢，液料比35∶1時，黃酮類化合物的得率達到最大值。交互項AC的響應面圖走勢較陡，影響顯著，與P值分析結果一致。

圖4 萃取溫度(A)、萃取時間(B)和液料比(C)對黃酮得率影響的等高線和3D響應面圖Fig.4 Contour map and 3D response surface graph showing the effects of extraction temperature(A)，extraction time (B) and liquid-solid ration (C) on the yield of flavonoids

2.4 驗證實驗

由響應面分析軟件預測，柚子皮黃酮的最佳萃取條件為：萃取溫度50.00 ℃，萃取時間1.62 h，液料比36.05∶1。模型預測柚子皮黃酮得率49.57 mg/g。為實際操作的可行性，最佳條件優化為：萃取溫度 50 ℃，萃取時間1.6 h，液料比36∶1，在此條件下進行3次驗證實驗，得到柚子皮黃酮的實際黃酮得率為(48.22±3.04)mg/g。

3 結論

采用雙水相法萃取柚子皮中黃酮的最佳條件為：硫酸銨質量分數30%，乙醇質量分數35%，萃取溫度為50 ℃，萃取時間為1.6 h，液料比為36∶1。該條件下，黃酮類化合物的得率為(48.22±3.04)mg/g。