不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)及指紋圖譜研究

高宇明，謝艷，張亞琴，何 琴，查 琪，陳興福，吳秀清*

(1.資陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 資陽(yáng) 641300；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，用于胸痹心痛、脘腹協(xié)痛、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛等[1]。丹參富含多種有效成分，如丹參酮類、丹酚酸類等。近年來(lái)的研究表明，丹參及其有效成分有抗腫瘤、抗血栓、抗炎、護(hù)肝等作用[2]。

目前，以丹參為原料的中成藥有100余種，丹參年需求量巨大，在四川、山東、陜西、河南、安徽等地均有廣泛種植[3]。由于各地丹參種質(zhì)不一，栽培管理方式不同，各地氣候、土壤、環(huán)境、光照差異，導(dǎo)致各地所產(chǎn)丹參質(zhì)量參差不齊[4]。關(guān)于各地丹參品質(zhì)的研究已有一些報(bào)道[5]，對(duì)丹參的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究也多集中在丹參酮類、丹酚酸類含量測(cè)定[6]，以及“一測(cè)多評(píng)”方法開(kāi)發(fā)[7-8]等方面。本研究收集全國(guó)主要丹參產(chǎn)地的栽培丹參樣品，分析其浸出物、丹參酮類、丹酚酸B的含量，建立指紋圖譜，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地丹參的質(zhì)量，為保證丹參藥材質(zhì)量穩(wěn)定提供技術(shù)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT液相色譜儀(配SPD-20A檢測(cè)器)，MS205DU電子天平(梅特勒托利多)，HY-8型搖床(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司)，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司)，TGL-16M型離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)，KQ-700DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試劑

丹酚酸B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院111562-201716)，丹參酮IIA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院110766-201721)，隱丹參酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院110852-201807)，丹參素鈉(中國(guó)食品藥品檢定研究院110855-201614)、迷迭香酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院111871-201706)純度均大于98%。甲醇和乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為注射用水，其他為分析純。

1.3 藥材

在不同產(chǎn)地收集的栽培丹參樣品，由資陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心吳秀清主任中藥師鑒定為丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)，具體信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地丹參藥材基本信息

2 樣品測(cè)定方法及結(jié)果

2.1 水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、丹參酮類、丹酚酸B含量測(cè)定

2.1.1 測(cè)定方法 參照《中國(guó)藥典》(2015年版)四部通則0832項(xiàng)下第二法測(cè)定各樣品的水分[9]；參照《中國(guó)藥典》(2015年版)四部通則2201項(xiàng)下的水溶性浸出物測(cè)定法冷浸法測(cè)定各樣品的水溶性浸出物含量；參照《中國(guó)藥典》(2015年版)四部通則2201項(xiàng)下的醇溶性浸出物測(cè)定法熱浸法以乙醇為溶劑測(cè)定醇溶性浸出物含量[10]。參照《中國(guó)藥典》(2015年版)一部中丹參含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定法測(cè)定丹參酮類(隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA三者之和)和丹酚酸B的含量[1]。

2.1.2 結(jié)果與分析 《中國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定丹參藥材水分不得過(guò)13.0%，水溶性浸出物不得少于35.0%，醇溶性浸出物不得少于15.0%，隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的總量不得少于0.25%，丹酚酸B不得少于3.0%[1]。由表2可知，5省產(chǎn)地的35個(gè)丹參藥材水分均符合規(guī)定。浸出物和含量測(cè)定結(jié)果差異較大，水溶性浸出物含量范圍為43.6%～65.6%，醇溶性浸出物含量范圍為14.6%～44.8%，丹參酮類含量范圍為0.180%～1.46%，丹酚酸B含量范圍為3.11%～8.31%。除山東莒縣庫(kù)山鎮(zhèn)1批樣品丹參酮類含量未達(dá)標(biāo)外，其他樣品均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)；水溶性浸出物含量整體偏高，最低者43.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)藥典要求的35.0%。從各產(chǎn)地平均值看，四川產(chǎn)丹參水溶性浸出物含量最高(64.2%)，但醇溶性浸出物含量最低(15.2%)；河南產(chǎn)丹參醇溶性浸出物含量最高(22.2%)。丹參酮類含量以山東莒縣最高，達(dá)1.46%，是藥典標(biāo)準(zhǔn)的6倍；另外，山東沂水、山東諸城、陜西洛南、四川雁江丹參丹參酮類含量也較高，在1.0%及以上；從平均值看，四川最高(0.985%)，安徽最低(0.562%)。丹酚酸B含量以河南孟州最高，達(dá)8.11%；陜西洛南、河南盧氏、安徽亳州、山東莒縣、山東五蓮含量較低，在4.0%以下；從丹酚酸B含量平均值看，四川最高(6.96%)，山東最低(5.17%)。

表2 35批丹參藥材水分、浸出物、指標(biāo)成分含量結(jié)果

2.2 指紋圖譜

2.2.1 檢測(cè)方法 指紋圖譜檢測(cè)參考香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)中丹參項(xiàng)下高效液相指紋圖譜鑒別方法[11]。取丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮IIA對(duì)照品適量，精密稱定，加合適溶劑制成每1 mL含20 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

取丹參粉末0.2 g，置50 mL離心管中，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，離心5 min(1 200 r/min)，取上清液移入25 mL量瓶中，用水10 mL在50 mL燒杯中洗滌殘?jiān)Q定重量，用表面皿覆蓋燒杯，加熱至約90 ℃，浸提30 min，放冷，再稱重，必要時(shí)用水補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)提取液，至同一量瓶中，加甲醇至刻度，于4 ℃左右放置過(guò)夜，用0.2 μm濾膜過(guò)濾后靜置至室溫，作為供試品溶液。

色譜條件：選用XselectR Hss T3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-(水∶乙腈∶甲酸=90∶1∶0.4)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～40 min，0%～30%；40～50 min，30%～80%；50～70 min，80%～85%)；流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 不同產(chǎn)地丹參指紋圖譜對(duì)照?qǐng)D譜生成及共有峰的指認(rèn) 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液注入液相色譜儀分析，記錄HPLC圖譜，通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)》軟件分析，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法為“中位數(shù)”法，通過(guò)多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰進(jìn)行全譜峰匹配，以S1為參照?qǐng)D譜，分析得到35批丹參樣品的對(duì)照指紋圖譜R，共得到13個(gè)共有峰(見(jiàn)圖1)，通過(guò)對(duì)照品(見(jiàn)圖2)指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰，分別為丹參素鈉(1號(hào)峰)、迷迭香酸(3號(hào)峰)、丹酚酸B(5號(hào)峰)、隱丹參酮(10號(hào)峰)、丹參酮IIA(13號(hào)峰)。其中5號(hào)峰峰面積較大，峰形較好，選擇作為參照峰，計(jì)算各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 丹參HPLC對(duì)照指紋圖譜

注：1.丹參素鈉；3.迷迭香酸；5.丹酚酸B；10.隱丹參酮；13丹參酮IIA

表3 35批丹參指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

2.3 35批丹參共有峰情況分析

從表4和表5可以看出，13個(gè)共有峰中峰面積RSD在27.0%～64.3%之間，指認(rèn)出的5個(gè)共有峰中，5號(hào)峰丹酚酸B含量最高，峰面積RSD為27.4%，說(shuō)明35批丹參中丹酚酸B含量較穩(wěn)定。其他共有峰中，RSD大于50%者有6個(gè)，表明各產(chǎn)地樣品的共有成分含量差異較大。

表4 35批丹參指紋圖譜共有峰峰面積RSD

2.4 35批丹參相似度評(píng)價(jià)

利用軟件計(jì)算樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似性，結(jié)果見(jiàn)表5。從分析結(jié)果可以看出，來(lái)自5個(gè)省的35批丹參藥材的相似度較高，相似度均在0.97以上，說(shuō)明丹參的質(zhì)量比較穩(wěn)定，各地丹參成分差異不大。比較各樣品的相似度，在0.99以下的有3批，2批為河南盧氏縣產(chǎn)、1批為山東莒縣產(chǎn)，說(shuō)明該3批丹參較其他丹參者有一定特殊性。結(jié)合產(chǎn)地調(diào)研情況分析，這可能與盧氏縣某些種植戶種植丹參有兩年采收的習(xí)慣有關(guān)。

3 討論

3.1 丹參質(zhì)量總體評(píng)價(jià)

表5 35批丹參相似度

從含量測(cè)定和指紋圖譜結(jié)果看，丹參質(zhì)量較好，基本都能滿足藥典規(guī)定的要求，且各地產(chǎn)丹參化學(xué)成分差異不大，丹參整體質(zhì)量水平較高，這與有關(guān)報(bào)道的結(jié)論一致[12]。但浸出物含量方面，各地丹參差異明顯，尤其是不同產(chǎn)地的脂溶性浸出物含量相差3倍左右。

3.2 各地丹參質(zhì)量比較

四川和山東為兩大丹參道地產(chǎn)區(qū)。山東丹參的核心產(chǎn)區(qū)為庫(kù)山地區(qū)，有文獻(xiàn)報(bào)道庫(kù)山丹參中丹參酮類含量較低[13]。本次研究從庫(kù)山地區(qū)采集的3個(gè)樣本中，丹參酮類含量分別為0.74%、0.74%、0.18%，均低于山東省平均值0.93%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)，庫(kù)山附近的旗山丹參酮類含量最高(1.46%)，這可能與丹參連作，產(chǎn)區(qū)向周邊轉(zhuǎn)移后，新的產(chǎn)區(qū)土壤環(huán)境較適合丹參酮類聚集有關(guān)。四川雁江為近幾年丹參的新產(chǎn)地，本次研究采集的2個(gè)樣品含量測(cè)定結(jié)果顯示，其水溶性浸出物、丹參酮類、丹酚酸B含量均較高，質(zhì)量較好。

目前研究表明，丹參中的脂溶性有效成分合計(jì)多達(dá)50余種[14]，在抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病方面有較高活性[15]。故下一步可對(duì)不同產(chǎn)區(qū)丹參的脂溶性成分差異開(kāi)展深入研究。