HPLC法測定燈盞花素葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛的含量及限度修訂

吳均成

(廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160)

燈盞花素葡萄糖注射液是用于治療缺血性腦血管疾病，如腦梗塞、腦出血后遺癥所致偏癱、冠心病、心絞痛、心肌梗塞及高黏血癥等和其他缺血性及伴有微循環障礙性疾病。目前僅國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-10001-(HD-1480)-2003收載此品種。5-羥甲基糠醛為葡萄糖或果糖脫水生成的化學物質，該物質對人體有害。本品為大輸液，且葡萄糖含量較大，出于安全考慮，需檢測樣品中5-羥甲基糠醛的含量。通過查閱相關資料和實驗考察，最終建立了高效液相色譜法，方法考察具體如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Chemstation色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；紫外分光光度計(日立U3900)。

1.2 試劑及樣品

甲醇(默克色譜純)、水(超純水)；冰醋酸；燈盞花素葡萄糖注射液(A廠，規格：250 mL，批號：20180301、20180302、20180303)、5-羥甲基糠醛對照品(中檢院)、5-羥甲基糠醛對照品(西亞試劑)；葡萄糖陰性對照溶液(企業提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

照高效液相色譜法(中國藥典2015年版通則0512)試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(規格250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.5%冰醋酸為流動相A，甲醇為流動相B，檢測波長284 nm，柱溫為40 ℃，進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 系統適用性溶液的制備 取5-羥甲基糠醛對照品溶液作為系統適用性溶液。

2.2.2 靈敏度溶液的制備 精密量取對照溶液1 mL，置于20 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 取本品原液作為樣品溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備 取5-羥甲基糠醛對照品，加水制成每1 mL中約含5-羥甲基糠醛5 μg的溶液作為對照品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取系統適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，5-羥甲基糠醛峰的理論塔板數符合要求，系統適用性見圖1。

2.4 輔料干擾試驗

5-羥甲基糠醛為葡萄糖或果糖脫水生成的產物，因此取葡萄糖陰性溶液作為輔料溶液，色譜見圖2。

t/min

t/min

2.5 耐用性試驗

實驗分別選擇了3條不同品牌規格的C18柱，3條色譜柱均能滿足系統要求，色譜見圖3至圖5。由于色譜柱2為短柱，主峰出峰時間過早容易與前面的輔料峰重疊，故本方法采用了色譜柱1(GL sciences Wondasil-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)進行實驗。結果見表1。

表1 耐用性考察色譜參數

t/min

t/min

t/min

2.6 線性關系考察

經試驗，5-羥甲基糠醛在0.611 1～7.638 4 μg/mL濃度范圍內呈線性關系，線性方程為y=125.32x+4.273 5，r=0.999 9(n=6)。

2.7 檢出限與定量限

按照信噪比S/N=10計算，5-羥甲基糠醛的定量限為0.064 μg/mL，按照信噪比S/N=3計算，5-羥甲基糠醛的檢測限為0.019 μg/mL。

2.8 重復性試驗

取樣品溶液(批號：20180301)6份分別進樣，5-羥甲基糠醛峰面積的RSD為1.3%(n=6)。表明方法重復性良好。

2.9 測定結果

三批樣品5-羥甲基糠醛測定結果見表2，供試品色譜見圖6。

表2 5-羥甲基糠醛測定結果

t/min

3 討論

3.1 色譜條件選擇

經查相關文獻[1-8]，高效液相色譜法測定5-羥甲基糠醛的流動相有：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液等流動相配型，但考慮到本品主成分在甲醇中溶解度較好且在酸中較穩定，于是擬定了以甲醇-0.5%冰醋酸(5∶95)為流動相；經二極管陣列檢測器全波長掃描，5-羥甲基糠醛在284 nm波長處有最大吸收且輔料無干擾，故擬定檢測波長為284 nm。

3.2 限度規定

中國藥典2015年版二部收載的“葡萄糖注射液”中，測定5-羥甲基糠醛的方法為紫外-可見分光光度法，在284 nm波長處測定吸光度，吸收值不得大于0.32，此時的葡萄糖樣品溶液濃度為10 mg/mL。取5-羥甲基糠醛對照品配制系列線性標準溶液，照紫外-可見分光光度法，在284 nm波長處測定吸光度，結果見表3。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出線性方程：y=0.119 8x+0.003 2，R2=1；根據中國藥典葡萄糖注射液中吸收值不得過0.32，根據線性方程得出本標準對5-羥甲基糠醛的限度濃度為2.644 4 μg/mL，即中國藥典葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛的限度相當于其葡萄糖標示量的0.0264 44%。結合樣品測定結果和出于對人體安全考慮，本方法限度設為0.01%。

表3 5-羥甲基糠醛紫外-可見分光光度法線性關系考察結果