UPLC法測定大鼠血清中蓽茇寧含量及變化規律

烏云索德，領 小，孟 和，昭日格圖

(1.內蒙古大學 化學化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古 呼和浩特 010010)

蓽茇(Long pepper)是胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗[1]，具有溫中散寒、理氣止痛的功效。現代藥理學研究發現，蓽茇具有顯著的降血脂作用，降血脂活性成分為蓽茇寧(piperlonguminine，GBN)[2-5]。藥物必須進入血液循環才能產生作用，血液中藥物的性質、濃度決定了其藥效和毒性[6]。超高液相色譜法(UPLC)具有靈敏度高、專屬性強等優點，已被廣泛用于藥物分析測定[7-9]。本研究采用超高效液相色譜儀建立了大鼠血清中蓽茇寧的含量測定方法并觀察不同給藥量與血液中藥物濃度的關系。該方法操作便捷、靈敏度高、選擇性好，可為蓽茇寧的吸收、代謝規律研究和臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司，配有恒溫自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱、Empower2色譜工作站)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TGL-16G冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；QL-901漩渦混合器(江蘇海門市麒麟醫用儀器廠)；KQ-300VDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EL204-IC電子天平(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)；Millipore-Q Plus超純水器(美國 Millipore公司)；RAININ 1 000 μL移液槍(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)等。

1.2 材料

蓽茇寧(自制，純度>98%)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 實驗動物

Wistar雄性大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(生產許可證號為SCXK(京)2012-0001)，體重為(200±20)g。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取50 mg蓽茇寧，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mg·mL-1的對照品儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。測定前用無水乙醇稀釋得不同濃度的對照品溶液，用于制備標準曲線。

2.2 給藥樣品制備及給藥方法

采用0.5%的CMC-Na將蓽茇寧制成不同濃度的混懸液，大鼠隨機分成空白組和5個給藥組，5個給藥組分別按照50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1劑量灌胃給藥，每天1次，連續灌胃3 d。末次給藥后0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h取血，放置30 min，3 000 rpm離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用。

2.3 血清樣品處理方法

取大鼠血清500 μL，加入4倍量乙腈，渦漩混合1 min，10 000 rpm離心15 min，取上清液，氮氣吹干，殘渣加入250 μL乙腈，渦漩溶解30 s，過0.22 μm微孔濾膜，進行UPLC分析。

2.4 色譜條件和分析條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters Corporation，USA)，流動相：乙腈-水(1∶1)，檢測波長：338 nm，流速：0.4 mL·min-1；進樣量：2 μL；色譜柱溫度：25 ℃。

3 結果與討論

3.1 方法專屬性

取大鼠空白血清、加入蓽茇寧標準品的空白血清、大鼠灌胃蓽茇寧后的血清，分別按血清樣品處理方法操作(“2.3”項下方法)，各樣品分別取2 μL注入超高效液相色譜儀，得到UPLC色譜，見圖1。由色譜圖可知，蓽茇寧的保留時間為1.98 min，給藥血清樣品色譜分離良好，血清內源性物質不干擾蓽茇寧的測定。

(a)：空白血清；(b)：空白血清中加入蓽茇寧；(c)：大鼠灌胃蓽茇寧后血清

3.2 標準曲線及線性范圍

取空白血清500 μL，加入蓽茇寧標準系列溶液50 μL，配制成蓽茇寧濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μg·mL-1的血清樣品。按照“2.3”項下血清樣品處理操作，取2 μL注入超高效液相色譜儀，得UPLC色譜建立標準曲線。以蓽茇寧濃度為橫坐標，蓽茇寧峰面積為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，得到線性方程y=68.45x-52.24(r=0.999 3，加權因子為1/x)，表明血清中蓽茇寧在0.5～15.0 μg·mL-1濃度范圍內與峰面積積分線性關系良好(見圖2)，定量限為0.5 μg·mL-1(信噪比>3)。

圖2 空白血清加入系列濃度的蓽茇寧后處理得到的標準曲線

3.3 精密度和準確度

取500 μL空白血清，加入適量蓽茇寧標準溶液，得到低、中、高3個濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質控樣品各5份，測定日內及日間精密度。每天1次，連續測定5 d日間精密度(結果見表1)。實驗數據表明，日內及日間精密度(RSD)均小于6%，說明該方法具有良好的精密度和準確度。

表1 大鼠血清中蓽茇寧的日間和日內精密度和準確度測定 (n=5)

3.4 穩定性

分別配制低、中、高3種濃度的蓽茇寧大鼠血清樣品，于室溫放置，每隔2 h進樣分析1次，考察蓽茇寧在樣品測定過程中的穩定性。每一濃度進行3次分析，結果表明樣品室溫放置24 h穩定。

3.5 回收率

取大鼠空白血清500 μL，按照“3.2”項下方法制備低、中、高3種濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質控樣品，每種濃度進行5次分析。另用乙腈代替血清，按照“2.3”項下方法處理，制備相應濃度的樣品，每種濃度進行5次樣本分析，獲得相應峰面積。結果表明回收率均大于65%，比較穩定，結果見表2。絕對回收率=測得樣品濃度(C測)/理論樣品濃度(C理論)。

表2 大鼠血清中蓽茇寧的回收率測定 (n=5)

3.6 樣品測定

將Wistar大鼠分成6個組，分別為空白組和5個給藥組(灌胃給藥劑量分別為50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1)，連續灌胃3 d，末次給藥后分別于0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h和12 h取血。采血后放置30 min，在3 000 rpm條件下離心15 min，取上清液。按照“2.4”項下方法處理，獲得血清樣品色譜，測定血清中蓽茇寧的濃度，測得藥時曲線見圖3。

圖3 大鼠灌胃不同劑量蓽茇寧后的血藥濃度-時間曲線

隨著灌胃劑量的增加，進入血液中蓽茇寧的濃度也有增加的趨勢。5個劑量以200 mg·kg-1為界限出現兩種不同的情況：200 mg·kg-1以下劑量，即50 mg·kg-1、100 mg·kg-1時，第1次出現最大血藥濃度的時間為1 h，第2次出現最大血藥濃度的時間為3 h；200 mg·kg-1以上劑量，即500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1時，第1次出現最大血藥濃度的時間為0.5 h。

4 結論

本研究結果表明，UPLC法具有靈敏度高、選擇性好、前處理方法簡單、回收率穩定、分析時間短(僅需5 min)的優勢，適用于大鼠血清中蓽茇寧的定性定量快速測定。

血藥濃度和時間曲線表明，隨著給藥劑量的增加，大鼠血清中的蓽茇寧濃度也逐漸升高。考慮到大鼠的個體差異性，灌胃給藥后，隨著時間的延長，蓽茇寧血清濃度是以曲線的形式下降的。