壯通飲抑制NADPH氧化酶2對糖氧剝奪誘導星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用

李 巖，覃啟京，梁慧薈，麻小梅，何 青，李曼菲，朱 亮，賴思嘉，楊 鶴，王凱華

(廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201)

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在很多生物體的化學反應中起遞氫體的作用，對機體具有重要意義，而NADPH氧化酶(NOX)是細胞內(nèi)一組具有氧化活性的蛋白，包含NOX1-5，DUOX1-2七種催化亞基。NOX2首先在吞噬細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，分布在多數(shù)器官中，是NOX亞型中分布最廣泛的。然而，越來越多的證據(jù)顯示，NOX2在非吞噬細胞內(nèi)也有表達，主要包括神經(jīng)元、心肌細胞、骨骼肌細胞等[1]。研究證明NOX2是其中影響腦損傷的重要亞型[2-3]，抑制NOX2的表達和活性可以減輕腦缺血再灌注損傷、血腦屏障破壞和腦水腫[4]。

壯醫(yī)經(jīng)驗方壯通飲主要由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮三味廣西特色壯藥配伍而成，是廣西壯族地區(qū)民間醫(yī)生根據(jù)壯醫(yī)理論從疏通人體“三道兩路”，調(diào)治巧塢(大腦)的角度出發(fā)，通過嚴謹配伍組成的治療腦梗死的經(jīng)驗方[5]。扶芳藤為衛(wèi)矛科植物的莖葉，味辛，性平，具有通龍路火路、舒筋脈、止出血、散瘀血的功效。藥理學研究顯示，預給藥后大鼠腦缺血再灌注腦組織中的c-fos含量下降，提示其有減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的作用[6]。急性毒性實驗顯示，扶芳藤藥性平和，毒性較低[7]。參三七是五加科植物的干燥根，是廣西民間常用名貴藥，味甘，微苦、溫，具有除瘀血、通龍路、止血、消腫止痛的功效。藥理學研究表明，其能顯著降低大鼠腦組織和血液中過氧化脂質(zhì)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，具有保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[5]。毒理研究表明，其劑量過大會出現(xiàn)溶血，停藥后可逐漸消失，臨床口服無溶血作用，安全可靠[8]。黃花倒水蓮為遠志科植物的根或全株，味甘，性微溫，具有祛濕解毒、補虛消腫、活血止血之功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，其能顯著降低大鼠血清丙二醛含量，提高SOD活性，具有抗氧化、清除自由基等作用[10]；同時能夠延長正常小鼠在缺氧和低溫狀態(tài)下的生存時間，具有抗氧化應激作用[11]。毒理學研究表明其毒性很小，小鼠的最大耐受倍數(shù)為246～262倍[12]。“三道兩路”指“氣道”(壯語lohheiq)“谷道”(壯語dungxsaej)“水道”(壯語lohramx)三道和“龍路”“火路”兩路。“三道”是人體生命活動的營養(yǎng)物質(zhì)化生、儲藏、輸布、運行的場所。龍路的功能主要是為人體各部分輸送營養(yǎng)，約束人體內(nèi)血液的運行，龍路的網(wǎng)絡遍布全身，其中樞在心臟，保障龍路的通暢是保證血液正常運行的前提條件。“火路”是人體受到內(nèi)外刺激后，對刺激做出反應的信號傳輸通路，相當于現(xiàn)代醫(yī)學的神經(jīng)系統(tǒng)。壯醫(yī)認為人之所以能感知天地之變化，主要為火路之功能，其中樞在“巧塢”(大腦)[13]。本研究應用體外培養(yǎng)的大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞缺糖缺氧模型，觀察壯通飲能否通過抑制NOX2對糖氧剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)導致的星形膠質(zhì)細胞損傷發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 壯通飲的制備

壯通飲：扶芳藤30 g、參三七10 g、黃花倒水蓮25 g。藥材去除雜質(zhì)切制后，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量的水，浸泡60 min 后，用TC-15 套式恒溫器250 V電壓加熱煎煮。沸騰后將電壓調(diào)低至150 V，保持微沸狀態(tài)煎煮1 h，濾取煎液。藥渣再加入生藥材8倍量的水，同法煎煮1 h，濾取煎液。合并2次煎液，于恒溫水浴鍋(100 ℃)蒸發(fā)去水分至濃稠狀，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱(60 ℃)干燥，得干浸膏，稱重，收膏率為36.8%，4 ℃保存，備用。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為2.0 g/mL。

1.2 動物

出生2天的雌性SD大鼠，SPF級，體重8～12 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(粵)2014-004。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 試劑

夾竹桃麻素(Apo，大連美侖，000020170316)，DMEM-F12培養(yǎng)液(美國Gibco，000020170406)，D-Hanks(中國吉諾，000020170321)，胎牛血清(FBS，美國Gibco，000020170312)，胰酶(美國Gibco，000020170325)，兔抗NOX2多克隆抗體(美國Abcam，000020170401)，羊抗鼠IgG抗體(中國博士德，000020170402)，二甲基亞砜(DMSO，美國sigma，000020170315)。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；低溫高速離心機(日立，CE16RX Ⅲ)

1.5 方法

本研究參照以往的方法[14]，取出生2天的SD大鼠處死，取腦皮質(zhì)，HanKs液洗3次，剪碎。①剪碎的組織轉(zhuǎn)入離心管中，加培養(yǎng)液，反復吹打后接種在培養(yǎng)瓶中；②剪碎的組織1 000 rpm離心5 min后取沉淀以0.25%胰酶消化5 min，以含血清的培養(yǎng)液終止消化，1 000 rpm離心5 min，取沉淀以完全培養(yǎng)液重懸并吹打成細胞懸液，接種在培養(yǎng)瓶中。差速黏附30 min后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。待較多細胞貼壁后換液，之后2～3天換液1次。培養(yǎng)7～12天長成致密單層細胞后37 ℃搖床振蕩18 h，次日以0.25%胰酶消化仍貼壁的細胞以傳代，免疫熒光鑒定。

取第四代星形膠質(zhì)細胞，參照以往的研究方法[15]，棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞3次，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿放入?yún)捬豕?含95% N2和5% CO2)將厭氧罐置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中，缺氧狀態(tài)下分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，更換正常培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間(復氧0 h、8 h、24 h)，模擬再灌注。實驗分組：①正常對照組：即陰性對照組，細胞不作任何處理；②糖氧剝奪組：單純糖氧剝奪組中的細胞，不加藥物干預，僅在密閉容器內(nèi)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h；③藥物組：在進行糖氧剝奪處理前1 h分別加入含壯通飲的培養(yǎng)液(濃度分別為20、40、80 mg·L-1)和夾竹桃麻素(NOX2抑制劑，濃度分別為0.05、0.25、0.5 mg·mL-1)。

1.5.1 星形膠質(zhì)細胞活性測定 采用CCK-8試劑盒測定，具體步驟參照以往研究方法[16]，細胞存活率(%)=(待測孔吸光度值-空白孔)/(對照組吸光度值-空白孔)×100%，實驗重復3次，取平均值。

1.5.2 免疫熒光染色 免疫熒光標記參照以往的研究方法[17-18]。種植在96孔板上的星形膠質(zhì)細胞用PBS(0.01 mol·L-1，pH=7.4)，輕柔沖洗3次，每次5 min，然后用4%多聚甲醛固定15 min。3%胎牛血清室溫封閉30 min。滴加一抗(兔抗GFAP，1∶400)，4 ℃過夜。PBS清洗細胞3次，5 min·次-1，滴加二抗(抗兔的二抗TRITC，1∶800)，避光室溫孵育2 h。Hoechst 33258避光染色10 min，清洗細胞2次，于熒光顯微鏡(ZEISS)下觀察并拍照。GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物。

1.5.3 Western Blot檢測NOX2蛋白表達 Western Blot參照文獻的研究方法[19]。使用細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA進行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗NOX2多克隆抗體，1∶1 000)，4 ℃過夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗小鼠單克隆抗體，1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，用化學發(fā)光顯色法顯影，定影，洗片。用Image J圖像處理軟件分析條帶的灰度值并進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及鑒定

星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)第9天分化成熟，形成神經(jīng)細胞網(wǎng)絡結構。GFAP免疫熒光染色顯示細胞質(zhì)呈紅色(圖3A)，Hoechst 33258染色顯示細胞核呈藍色(圖3B)，胞質(zhì)呈紅色的即為星形膠質(zhì)細胞，細胞純度>98%(圖3C)。

圖3 星形膠質(zhì)細胞免疫熒光染色

2.2 糖氧剝奪對星形膠質(zhì)細胞活力的影響

缺糖缺氧8 h后，糖氧剝奪組與對照組比較，細胞活力變化沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。缺糖缺氧12 h后，糖氧剝奪組與對照組比較，細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后，糖氧剝奪組與對照組比較，細胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后細胞生存率下降最顯著，降至(65.91±8.21)%。見表1。

表1 缺糖缺氧8，12，24 h，星形膠質(zhì)細胞的細胞活力測定結果

2.3 壯通飲對正常星形膠質(zhì)細胞生長的影響

正常培養(yǎng)8 h后，對照組和不同濃度壯通飲預處理組之間比較，細胞活力沒有差異(P>0.05)。正常培養(yǎng)24 h后，壯通飲40 mg·L-1和80 mg·L-1預處理組與對照組比較，細胞活力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 壯通飲對正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞活力影響的測定結果

2.4 壯通飲對糖氧剝奪后不同時間星形膠質(zhì)細胞活力的影響

復氧(再灌注)后0 h，糖氧剝奪組和不同濃度壯通飲預處理組之間比較，細胞活力沒有差異(P>0.05)。復氧后8 h，壯通飲40 mg·L-1和80 mg·L-1預處理組與糖氧剝奪組比較，細胞活力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復氧后24 h，壯通飲80 mg·L-1預處理組與糖氧剝奪組比較，細胞活力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 壯通飲對復氧0 h、8 h、24 h星形膠質(zhì)細胞活力影響的測定結果

2.5 壯通飲及夾竹桃麻素對糖氧剝奪/再灌注誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷中NOX2表達的影響

Western Blot顯示，復氧后0 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細胞NOX2表達水平與對照組比較升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同濃度三壯通飲預給藥對星形膠質(zhì)細胞NOX2表達的影響與糖氧剝奪組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復氧后8 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細胞NOX2表達水平與對照組比較升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同濃度壯通飲預給藥組星形膠質(zhì)細胞NOX2表達水平降低，與糖氧剝奪組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果顯示壯通飲對NOX2表達起抑制作用。夾竹桃麻素是NOX2的抑制劑，糖氧剝奪后復氧0 h、8 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細胞NOX2表達水平與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。夾竹桃麻素預給藥組(0.25 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1)星型膠質(zhì)細胞NOX2表達水平與糖氧剝奪組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

表4 壯通飲及夾竹桃麻素對糖氧剝奪復氧0 h、8 h星形膠質(zhì)細胞NOX2表達影響的測定結果

腦卒中是危害人類健康最重要的疾病之一，其中缺血性卒中占所有卒中類型的85%，是致殘和致死的首要和第二位病因[20]。急性缺血性卒中對腦血流的損害導致了腦缺氧和細胞凋亡。盡早恢復腦血流再通對于急性缺血性卒中患者至關重要。目前恢復血流再通的主要治療方法是溶栓，但由于治療時間窗過短及潛在的出血風險極大限制了其在臨床中的廣泛應用[21]。因此，我們迫切需要針對急性缺血性卒中的新療法。通過干預腦組織缺血缺氧所引起的一系列生理病理改變，保護缺血引起的神經(jīng)損傷(即神經(jīng)保護)，對于缺血性卒中的治療具有極其重要的意義。目前，很多學者都在嘗試研究通過神經(jīng)保護減輕或逆轉(zhuǎn)腦缺血的藥物及其制劑[22]。研究證實壯通飲具有廣泛的藥理作用，包括擴張血管、抗氧化、抗凝、降低血液黏稠度、降血糖、改善微循環(huán)、抑制血栓形成等[23]。本實驗結果顯示壯通飲能夠提高正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的細胞活力，對糖氧剝奪/再灌注誘導的細胞損傷具有保護作用。結果顯示正常培養(yǎng)24 h，壯通飲能夠增強細胞活力，但糖氧剝奪導致細胞活力下降，其中24 h細胞活力下降最明顯，說明糖氧剝奪對星形膠質(zhì)細胞具有損傷作用。而復氧后8 h和24 h，不同濃度的壯通飲分別能夠增強糖氧剝奪后的細胞活力，說明壯通飲對糖氧剝奪造成的細胞損傷具有保護作用，同時也表明壯通飲的神經(jīng)保護作用呈現(xiàn)出劑量依賴的特點。

NADPH氧化酶(NOX)在卒中的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，尤其是NOX2在缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色[24-25]。既往有很多研究已經(jīng)證實抑制NOX2活性能夠預防和治療缺血性腦損傷[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪增強了NOX2在星形膠質(zhì)細胞中的表達，并證實NOX2在糖氧剝奪導致的星形膠質(zhì)細胞缺血性損傷中發(fā)揮了重要作用。壯通飲能夠抑制糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細胞中NOX2的表達，說明壯通飲對缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護作用，而這種保護作用正是通過抑制NOX2的活性起作用的。為進一步驗證壯通飲通過抑制NOX2發(fā)揮神經(jīng)保護作用，我們使用夾竹桃麻素這種NOX2抑制劑進行實驗，結果顯示夾竹桃麻素能夠抑制糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細胞中NOX2的表達，說明壯通飲能夠發(fā)揮與NOX2抑制劑相同的作用。研究證實NOX2產(chǎn)生的活性氧(ROS)是體內(nèi)ROS的主要來源，ROS的產(chǎn)生加劇了缺血性腦損傷。我們的研究結果表明壯通飲通過抑制NOX2的活性發(fā)揮保護星形膠質(zhì)細胞缺血性損傷的作用可能是通過抗氧化機制來實現(xiàn)。但還需要更深入的研究來探索壯通飲發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制，并進一步在體內(nèi)(動物)實驗中驗證這些結果。

綜上所述，壯通飲對糖氧剝奪誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷具有保護作用，這種保護作用主要是通過抑制細胞內(nèi)NOX2的活性來實現(xiàn)的。