子宮內膜漿液性癌通過免疫組化和原位雜交檢測HER2/neu蛋白過表達與基因擴增的對照及可行性研究*

張建筑，袁士成，彭曉峰，趙文麗，易智君，劉鏡文，楊 紅，秦文華，侯衛華

1.惠州市第一人民醫院病理科，廣東 惠州 516000；2.惠州市中心人民醫院病理科，廣東 惠州 516000；3.惠州市第一婦幼保健院病理科，廣東 惠州 516000；4.平煤神馬醫療集團總醫院病理科，河南 平頂山 467000；5.解放軍第989醫院病理科，河南 平頂山 467000

子宮內膜癌是女性生殖系統中較常見的腫瘤，ESC約占所有子宮內膜癌的8.7%～10.2%。ESC惡性程度高，對常規化療藥物易出現耐藥，治療效果差，復發率高。約50%病例確診時已伴有子宮外病變，此部分病例中，約30%～50%未發現明確的子宮肌層浸潤［1］。在精準醫療時代，為降低ESC患者的復發及死亡率，有必要對可能存在的靶向治療的靶點HER2/neu進行研究。在乳腺癌和胃癌中，人表皮生長因子受體2（HER2/Neu，C-ERBB2）HER2蛋白過表達和（或）擴增病例，其評價標準和應用靶向藥物曲妥珠單抗治療的規范化流程和治療效果已得到確認［2-4］。針對HER2表達的異質性研究，反映這些腫瘤的獨特的生物特征和預測對HER2靶向治療的臨床效果［5-8］也取得了一些成果。雖然HER2/neu的子宮內膜癌的研究已經近20年，但并沒有形成完整的評價標準和指南，以致在子宮內膜癌中抗HER2藥物的應用沒有準確的HER2/neu擴增狀態的依據，研究得到的結果受到質疑［9-16］。如有研究HER2過表達或HER2擴增均與無進展生存期或總生存期無關［17］；還有部分研究提示，曲妥珠單抗作為單一藥物并未顯示出對具有HER2過表達或HER2擴增的子宮內膜癌的活性。在所有此類研究中，HER2過表達和（或）基因擴增的病例所占各自研究病例的14%～80%，從這些結論中可以肯定的推斷，至少有部分研究在對HER2過表達和（或）基因擴增的評價標準和解讀是存在錯誤的［9-15］。所以，對HER2/neu基因狀態的準確評估非常重要，將嚴格篩選的HER2/neu蛋白過表達和/或基因擴增病例入組抗HER2藥物治療，所得到的療效結果才是準確可靠的［18］。近年來，有研究顯示，二代抗HER2/neu藥物如達可替尼、阿法替尼等對化療耐藥的HER2/neu基因擴增的ESC顯著有效［19-20］；絡氨酸酶抑制劑與抗HER2藥物的聯合應用以及卡鉑-紫杉醇聯合曲妥珠單抗在治療ESC的研究也取得了很大的進展［21-24］。因此，有必要對新型抗HER2/neu藥物在對化療耐藥的HER2/neu基因擴增ESC患者中臨床應用進行研究。基于以上情況，我們采用ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測指南評分標準，對ESC病例HER2過表達和（或）基因擴增情況進行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2018年5月間71例惠州市第一人民醫院及四家友好醫院（惠州市中心人民醫院、惠州市婦幼保健院、平煤神馬醫療集團總醫院、解放軍第989醫院）初發ESC手術切除標本蠟塊，所有患者術前均未做放、化療，病人年齡50～82歲。免疫組化：一抗為上海基因公司兔抗人HER2，SP3單克隆抗體；其它所需配套試劑來自Leica（德國）公司；全自動免疫組化儀為Leica BOND-Ⅲ，來自Leica（德國）公司。FISH檢測所用HER2-DNA探針試劑盒為Histra HER2 FISH Kit試劑盒，購自日本常光公司。免疫組化及FISH操作步驟均嚴格參照儀器使用流程和試劑使用說明。

1.2 方法

（1）所選用標本蠟塊均為嚴格按照FISH及IHC固定要求（離體時間小于30 min，充分剖開，組織體積10倍左右4%中性甲醛固定6-48 h）。（2）常規石蠟切片，HE染色、IHC切片厚度均為4μm。（3）IHC染色采用乳腺癌評分HER2（3+）和HER2（0）做為陽性、陰性對照，染色評價后，按照ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南評分標準對結果進行判讀，按評分分為4組（3+組、2+組、1+組、0組），選取每個蠟塊IHC表達最強部分直徑0.4 cm組織，組內優先原則，每4塊組織同乳腺癌陽性、陰性（FISH實驗證實）對照制作一個組織芯片，組內不足4塊則由其他組補入，最終制作組織芯片18個，供FISH實驗使用。（4）組織芯片FISH切片厚度為4μm。

1.3 結果判定

參照ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測指南［25］的判定標準：（1）免疫組化化學。HER2蛋白表達陽性HER2（3+）：≥10%腫瘤細胞呈現強而完整的膜陽性；HER2蛋白表達不確定HER2（2+）：≤10%腫瘤細胞出現強而完整的膜陽性和/或＞10%細胞出現不完整的弱至中等強度的細胞膜染色；HER2蛋白表達陰性HER2（1+）、HER2（0）：＞10%的浸潤性癌細胞呈現不完整的、微弱的細胞膜染色判度為HER2（1+）；腫瘤完全陰性或≤10%細胞出現不完整、微弱的細胞膜染色判讀為HER2（0）。【注：在本次研究中，將IHC中強的U型著色（基底膜和側膜著色）判定等同于完整的膜陽性；將染色強度（5個級別：無信號、微弱表達、弱表達、中等輕度表達、強表達）差異至少占腫瘤5%的比例定義為免疫組化染色異質性】。（2）FISH HER2/neu基因擴增：HER2/CEP17≥2.0和/或HER2拷貝數/細胞數≥6，若HER2/neu信號連成簇，則不用計算比值，直接判定為HER2/neu基因擴增；HER2/neu基因未擴增：HER2/CEP17＜2.0且HER2拷貝數/細胞數＜4；HER2/neu基因擴增不確定：HER2/CEP17＜2.0且6＞HER拷貝數/細胞數≥4。FISH/HER2蛋白符合率：HER2/neu擴增數+HER2/neu基因未擴增數/HER2（3+）+HER2（1+）+HER2（0）；HER2/neu基因擴增率：HER2/neu基因擴增數/病例總數。（注：本次HER2/neu的免疫組化結果和FISH結果均由兩名有資質醫師單獨閱片，最后兩人得出的結果進行參照、對比，不一致病例進行討論、重新評估，最終得出結果）。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER2IHC評分分布及HER2/neu FISH結果的對照

所有71例病例均進行免疫組化HER2蛋白和FISH基因擴增檢測。根據ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南進行評分，其中HER2（3+）18例；HER2（2+）17例；HER2（1+）26例；HER2（0）10例；其中有24例病例出現IHC表達的異質性。應用FISH實驗檢測：HER2（3+）病例中有16例HER2/neu基因擴增， 1例未擴增，1例HER2/neu基因擴增不確定；HER2（2+）病例中，4例HER2/neu基因擴增，11例HER2/neu基因未擴增，2例HER2/neu基因擴增不確定；HER2（1+）病例中，1例HER2/neu基因擴增，25例HER2/neu基因未擴增；HER2（0）病例中，HER2/neu基因擴增病例數為0。除去HER2（2+）不確定病例，FISH/HER2免疫組化符合率為94.4%（51/54），HER2基因擴增率為29.5%（21/71），見表1，圖1。通過FISH檢測我們還發現，有45.1%（32/71）的病例顯示17號染色體多體（HER2/CEP17＞2.5）。

表1 HER2IHC評分分布及HER2/neu FISH結果的對照 例

2.2 HER2IHC異質性與基因擴增對照

在IHC評分中，有24例病例出現了ICH表達的異質性，其中有11例（52.4%，11/21）HER2/neu基因擴增病，HER2/neu未擴增及不確定病例中IHC表達異質性所占比例為（26%，13/50），二者間比較，差異無統計學意義（P=0.065），見表2，圖1。

表2 HER2IHC異質性與基因擴增對照 例(%)

圖1 子宮內膜漿液性癌的HER2免疫組化表達和HER2/neu基因擴增

3 討論

本次研究得出了三個結論：（1）ESC中應用ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南進行判讀，FISH基因擴增檢測和IHC免疫組化過表達情況有高度的一致性94.4%（51/54）；（2）在ESC中，有29.5%的病例出現HER2/neu基因擴增；（3）在ESC中，HER2蛋白的IHC表達存在較高的異質性33.8%（24/71）。

正確評估靶向藥物靶點的狀態對入組靶向藥物治療起決定性作用。乳腺癌和胃癌的HER2檢測指南已經完備并隨著研究進展不斷更新，ASCO/CAP在2018年對乳腺癌HER2檢測指南進行了更新［26］，根據該標準的更新，中國乳腺癌專家組制定了《乳腺癌HER2檢測指南（2019版）》［27］。目前國內外尚無針對ESC的HER2檢測指南及抗HER2靶向藥物的應用規范。漿液性子宮內膜癌是子宮內膜癌最具生物學攻擊性的變體，具有較高的復發率和對常規化療的相對耐藥性，這對腫瘤科醫生提出了重大的治療挑戰［28-30］。在以往子宮內膜漿液性癌HER2研究中，缺乏規范的HER2檢測標準來顯示HER2/neu的基因狀態，導致研究中HER2過表達率在14%～80%［8-12,31-36］，這種不規范性主要體現在，部分研究沒有將Ⅰ型、Ⅱ型子宮內膜樣癌分開研究，甚至有人將惡性苗勒氏混合瘤也納入研究組中［8-16］。雖然部分研究是依照ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南或FDA（食品藥品管理局）標準對IHC結果進行判讀，但有的將HER2蛋白評分（2+）和（3+）的病例完全納入HER2/neu基因擴增病例，對HER2狀態的評估的不規范，導致最后應用抗HER2靶向藥物的療效產生不同的結果。近年來一些研究顯示，應用新型抗HER2/neu基因的靶向藥物或聯合應用絡氨酸激酶抑制劑等其它藥物，會使HER2/neu基因擴增的ESC病人受益［21-24］。

本研究是基于ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南對ESC的HER2/nue的IHC蛋白表達和FISH基因擴增進行的，研究顯示，ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南應用于評價ESC的HER2/neu基因擴增情況時，除去IHC判讀HER2（2+）病例，IHC和FISH符合率為94.4%（51/54），有較高的符合率，說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南在檢測ESC的HER2/neu基因狀態是適用的。

HER2/neu的IHC表達和基因擴增特征在不同組織來源和組織學類型會有差異。在乳腺癌中，同一腫瘤中HER2/neu的IHC表達和（或）基因擴增的一致性比較高，出現表達和（或）擴增的異質性比較少見［37-38］；但是在胃癌中，許多病例HER2/neu的IHC表達和（或）基因擴增狀態在同一腫瘤內的不同區域會顯示出明顯的異質性［39］。針對IHC蛋白表達的異質性，在胃癌的活檢標本中對于HER2/nue表達評價有專門的指導意見，在活檢標本中，只要存在成簇的至少5個腫瘤細胞出現強的細胞膜著色，即可判定為HER2（3+）［8］。在我們的研究中，ESC的HER2/nue蛋白表達與胃癌相似，較多病例表現出了明顯的異質性，僅在HER2/neu基因擴增的病例中，就有52.4%（11/21）。我們得到的數據，可以對子宮內膜診刮標本中HER2/neu的HER2/neu的免疫組化表達評價提供類似胃癌的建議。由于ESC中的IHC蛋白表達存在比例較高的異質性，所以我們建議：對于ESC的HER2/neu的蛋白過表達和（或）基因擴增狀態的評估應采取大切片或多切片。

在胃癌病例中，會出現HER2/neu蛋白IHC表達只在基底膜和側膜著色，而頂膜不著色，出現“U”形染色。在子宮內膜漿液性癌中，也出現類似胃癌中的“U”形染色模式，尤其是在分化較好的、具有明確的腺管樣結構的腫瘤或腫瘤區域。我們的研究發現，根據ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南，把“U”型染色等同于完整膜染色，HER2（3+）的病例經FISH檢測HER/neu均擴增。證明根據“U”形染色陽性強度和比例來對HER2/neu的IHC進行評分是可行的。

綜上所述，在ESC中，評價HER2/neu的IHC過表達和/或基因擴增情況，應用ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南進行判讀，IHC和FISH結果取得了較高的一致性，說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南是可以應用于ESC的HER2/neu的過表達和（或）基因擴增評估的；HER2/neu蛋白的IHC表達，存在在同一ESC腫瘤中較大比例的異質性，因此建議腫瘤應大切片、多取材；“U”型染色在ESC中，在ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南評價標準下，可等同完整的膜染色。隨著對HER2/neu的研究，針對HER2/neu基因擴增的ESC病例的治療管理模式需要轉變［40］。本次研究僅進行了HER2/neu免疫組化染色和FISH結果的對比及ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南在ESC中使用的可行性的研究，HER2/neu蛋白過表達和（或）基因擴增病例應用抗HER2藥物后治療效果的評價還有待于進一步研究。