TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化相關性研究

趙宇青，何其勇，國麟祺

佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002

TGF-β能調節(jié)細胞生長和分化，TGF-β超家族包括多種TGF-β同種壓型，盡管結構相似，但這些配體基于其細胞、組織特異性表達，它們與抑制性分子的相互作用以及它們與之復合的受體形成獨特組合而引起不同的生物反應［1］。TGF-β1可誘導上皮-間質轉化已被廣大學者所接受［2-3］。TGF-β1是重要的促使上皮細胞向成纖維細胞分化的因子［4］，是上皮間質轉化中的關鍵因子,同時Smad2/3信號通路是TGF-β1作用的經典通路之一。另有研究認為，膽管癌細胞發(fā)生EMT是其發(fā)生遠處轉移前的必經之路［5-7］。故本研究就TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化之間相關性做如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膽管癌細胞QBC939（中國科學院上海細胞庫）、TGF-β1誘 導 劑（Selleckchem）、RPMI1640（Transgenbiotech）、優(yōu)質胎牛血清（HyClone），其余實驗材料均來自佳木斯大學實驗室。

1.2 細胞培養(yǎng)

在RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，于37℃、5%CO2、95%空氣的飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞可貼壁生長，每天多次于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，并適時更換培養(yǎng)液。

1.3 TGF-β1誘導膽管癌細胞發(fā)生EMT

將膽管癌細胞QBC939消化離心后制成細胞懸液，向6孔板中接種，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。使細胞生長均勻，直至貼壁。待顯微鏡下觀察細胞已長至6孔板底壁的80%左右，向瓶中加入約2 m l RPMI-1640培養(yǎng)液，饑餓細胞12 h過夜后加入TGF-β1母液。將實驗組分為三組，分別設置濃度為1.0、5.0和10.0 ng/mL TGF-β1母液進行培養(yǎng)，對照組僅用含胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。分別于12、24和48 h后觀察細胞形態(tài)變化并拍照。選取變化最明顯的一組，用Western Blot法檢測E-cadherin及N-cadherin表達情況。

1.4 劃痕愈合實驗測定遷移能力

取對數(shù)期生長細胞，經胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，使細胞濃度為5×105個/m l，將細胞接種到6孔板，待細胞鋪滿板底后，用200μl槍頭垂直標記線劃痕，加入PBS沖洗3遍，去除劃下的細胞，按對照組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、TGF-β1（1 ng/m l組、5 ng/m l組10 ng/m l組）分為四組，分別處理后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Image J軟件測量0 h和24 h劃痕寬度的變化，用閉合率代表各組的細胞遷移能力，閉合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 MTT檢測增殖能力

細胞培養(yǎng)到細胞生長對數(shù)期時進行對比試驗，取200 μl膽管癌細胞株QBC939懸浮液接種到96孔板。接種的要求：2 000個/孔、每組設5個復孔，并設調零孔，將細胞放置于TGF-β1（1、5、10 ng/m l）進行處理，12 h后，取出一塊板塊中的每孔加入5 mg/m l MTT 20μl，而后按照正常的細胞培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，遺棄孔內上清液，加入150μl DMSO，振蕩8 min使結晶物充分溶解。按照上述實驗辦法，分別做經歷TGF-β1處理24 h、48 h、72 h的試驗。而后用酶標儀上檢測，檢測辦法為：630nm波長為參考值，在490 nm波長處測定吸光度A值，重復三次。增值率=［（實驗組A值-調零孔A值/對照組A值-調零孔A值）-1］×100%。

1.6 Western blot檢測TGF-β1-Smad信號通路下游相關蛋白表達

培養(yǎng)瓶中的細胞用胰酶消化，計數(shù)后按每孔0.1×106鋪于12孔板，第2天細胞培養(yǎng)至70%～80%融合。實驗設置對照組（只加含胎牛血清進行培養(yǎng)基），TGF-β1組加入終濃度為5 ng/m l的TGF-β1誘導48 h，待膽管癌細胞發(fā)生EMT后，各組細胞用冰預冷的RIPA細胞裂解液分別裂解，離心收集上清。調整各個提取樣本的總蛋白濃度為2μg/m l，取20μl總蛋白，經12%SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。采用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，用TBST洗膜(3次)，用化學發(fā)光法(ECL)顯色，由凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用ImageJ軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

計量數(shù)據以例數(shù)百分比（%）表示，兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1誘導膽管癌細胞發(fā)生EMT

分別利用不同濃度（1.0、5.0和10.0 ng/m l）TGF-β1誘導細胞，在不同時間點（12、24、48 h）利用相差光學顯微鏡評估TGF-β1誘導的細胞形態(tài)學變化。結果顯示，QBC939細胞培養(yǎng)在空白對照組呈現(xiàn)經典的鵝卵石上皮形態(tài)和生長模式，5 ng/m l TGF-β1在24 h可以使QBC939細胞發(fā)生形態(tài)改變，48 h之后更加顯著。經過10 ng/m l TGF-β1處理后，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，極性喪失，細胞變得離散，呈現(xiàn)更多的纖維母細胞形態(tài)并減少了細胞間的連接（圖1）。選取TGF-β1 10ng/m l組中的膽管癌細胞進行Western blot試驗，結果顯示，與對照組相比，實驗組中細胞黏附分子E-cadherin蛋白水平下降（P＜0.05），而N-cadherin表達顯著上調（P＜0.05）（圖2-1和圖2-2），證明在此過程中TGF-β1誘導QBC939細胞發(fā)生了EMT。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 鏡下觀察各濃度TGF-β1培養(yǎng)膽管癌細胞各時間點細胞形態(tài)

圖2-1 Western blot試驗檢測各組QBC939細胞E-cadherin及N-cadherin的表達情況

圖2-2 對照組與TGF-β1組E-cadherin及N-cadherin蛋白相對表達量

2.2 TGF-β1可促進膽管癌細胞遷移

1ng/m l組膽管癌細胞閉合率為（43.37±0.14）%；5 ng/m l組膽管癌細胞閉合率為（63.26±0.37）%；10 ng/m l組膽管癌細胞閉合率為（72.94±0.56）%，均高于對照組閉合率（34.64±0.75）%（圖3），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各濃度TGF-β1培養(yǎng)膽管癌細胞后各組膽管癌細胞遷移情況

2.3 TGF-β1可促進膽管癌細胞增殖

與對照組比較，1、5、10ng/m l組在不同時間點所測出的增值率均大于對照組（表1），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 對照組與TGF-β1不同濃度組膽管癌細胞增值率 %

2.4 膽管癌細胞發(fā)生EMT后TGF-β1-Smad信號通路下游蛋白表達增加

Western blot結果顯示，與對照組相比，發(fā)生上皮-間質轉化的REB中，TGF-β1-Smad信號通路下游相關蛋白P21WAF、VEGF、TSP-1、uPA、smad、Bmi-1表達均較對照組增加（圖4和圖5），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 膽管癌細胞發(fā)生EMT前后TGFβ1-Smad信號通路下游蛋白表達量

圖5 Western blot試驗檢測膽管癌細胞發(fā)生EMT前后TGFβ 1-Smad信號通路下游蛋白表達情況

3 討論

膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤,在解剖學上分為肝內、肝外和肝門部膽管癌。膽管癌早期診斷較消化系統(tǒng)其他部位惡性腫瘤困難，且進展較其他惡性腫瘤迅速且該部位解剖關系復雜。有統(tǒng)計數(shù)據顯示膽道系統(tǒng)惡性腫瘤惡性程度及其發(fā)病率與胰腺癌相仿。除外科手術治療外，該病對化療藥物及放療治療均不敏感［8］。其可沿膽管上下組織間隙、淋巴管引流和周圍神經鞘侵潤［9］。臨床上缺乏特異性的腫瘤標志物，絕大多數(shù)患者明確診斷時已失去手術根治的機會［10］。目前并無確實有效的方法對膽管癌未手術患者進行抗腫瘤治療［11］。研究表明膽管癌細胞發(fā)生遠處轉移與膽管癌細胞發(fā)生EMT密切相關。EMT是指在生理及病理情況下發(fā)生細胞上皮間質轉變，同時伴隨細胞形態(tài)與相關基因表達的改變。在胚胎形成以及組織器官發(fā)育中起著至關重要的作用，同時也參與器官纖維化和腫瘤的形成［12］。EMT以上皮細胞極性的喪失及間質特性的獲得為重要特征，同時使細胞在細胞功能及代謝等多個方面均發(fā)生改變。正常細胞間通過細胞的極性及E-cadherin的表達，形成細胞間的緊密和粘附連接，當EMT發(fā)生時，細胞極性消失并獲得間質特性，便可為腫瘤細胞通過基底膜創(chuàng)造機會。整個上皮-間質轉化過程中，上皮細胞的標志物表達下調，如E-cadherin、p-連環(huán)素（p-Catenin）、a-連環(huán)素（a-Catenin）、c-連環(huán)素（c-Catenin）等；相反，間質表型標記物表達上調，如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等，而N-cadherin表達上調和E-cadherin表達下調有助于腫瘤細胞脫離原發(fā)灶［13-14］，進而發(fā)生遠處轉移。鑒于過度活化的TGF-β及其受體所介導的細胞信號通路在肝癌、胰腺癌、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）等惡性腫瘤及組織纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。關于靶向抑制TGF-β的分子靶向治療成為科學研究的熱點所在。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以誘導膽管癌細胞發(fā)生上皮間質轉化，使N-cadherin表達上調和E-cadherin表達下調，進而表現(xiàn)出間質特性。還可以增強膽管癌細胞的遷移及增值能力，且具有時間和濃度依賴性。這為膽管癌細胞發(fā)生遠處提供了有利條件。而相對于一般膽管癌細胞而言，發(fā)生了EMT的膽管癌細胞中TGF-β1-Smad信號通路下游蛋白表達也相應增加，說明膽管癌細胞發(fā)生EMT的過程與該信號通路的異常激活密切相關。

綜上所述，TGF-β1在膽管癌細胞發(fā)生EMT的過程中起到至關重要的作用，同時TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化之間具有相關性。抑制TGF-β1可能為研究膽管癌發(fā)生發(fā)展提供新的、潛在的依據。