西馬特羅單克隆抗體制備以及酶聯(lián)免疫試劑盒的研究

吳小勝，臧勇軍，李 斌，賈芳芳，萬(wàn)宇平，馬玉華，何方洋*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司，河南 漯河 462003；3.廣州市從化區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東 廣州 510900；4.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206）

瘦肉精是一類藥物的統(tǒng)稱，任何能夠抑制動(dòng)物脂肪生成，促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)的物質(zhì)都可以成為“瘦肉精”，能夠?qū)崿F(xiàn)此類功能的物質(zhì)主要是一類稱為β-受體激動(dòng)劑的藥物。西馬特羅是繼鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、硫酸特布他林等藥物之后的新型瘦肉精。自2011年瘦肉精事件爆發(fā)以來(lái)，引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視，為了保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，保護(hù)人類健康，許多國(guó)家都禁止在食源性動(dòng)物生產(chǎn)中使用瘦肉精，我國(guó)政府對(duì)瘦肉精藥物的監(jiān)管力度不斷加大，雖然在2000年提出禁止使用瘦肉精，但在畜牧業(yè)生產(chǎn)中瘦肉精的使用仍屢禁不止，不法養(yǎng)殖戶急于尋求新型瘦肉精，西馬特羅就是其中之一。西馬特羅能夠促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積、促進(jìn)脂肪分解抑制脂肪沉積，提高瘦肉率。但其代謝速度較慢，可能導(dǎo)致上市后藥物殘留量較大，消費(fèi)者食用后可能會(huì)出現(xiàn)心率加快，面部潮紅，面頸、四肢肌肉顫動(dòng)，手抖，不能站立，頭暈，乏力，口干，嘔吐、腹痛等癥狀。基于上述情況，農(nóng)業(yè)部明確了西馬特羅等瘦肉精品種禁用于養(yǎng)殖動(dòng)物[1-3]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，檢測(cè)瘦肉精殘留的常用方法有超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-8]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-14]、高效液相色譜法等[15]。儀器方法準(zhǔn)確性高，但是需要高成本大型儀器，并由專業(yè)人員進(jìn)行操作，耗時(shí)久，以至于基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室無(wú)法承擔(dān)資金成本和時(shí)間成本均較高的儀器方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備西馬特羅半抗原，載體蛋白與之偶聯(lián)合成免疫原，免疫原用于免疫動(dòng)物，獲得抗西馬特羅單克隆抗體，目的在于利用酶聯(lián)免疫吸附原理，將其用于研制出檢測(cè)豬尿中西馬特羅殘留的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能夠解決上述的儀器高成本問(wèn)題，較好地解決了基層實(shí)驗(yàn)人員的日常檢測(cè)難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西馬特羅、溴布特羅、克倫特羅、溴氯布特羅、塞布特羅、馬布特羅、克倫潘特、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫巴胺、特布他林、妥布特羅、馬噴特羅、氯丙那林、羥甲基克倫特羅、噴布特羅、鹽酸班布特羅、菲諾特羅、齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%）：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甲醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白（均為分析純）、辣根過(guò)氧化物酶：北京百欣試劑公司；豬尿：來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)；濃縮洗滌液：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；Balb/c小鼠：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3酶標(biāo)儀（最大量程為4.0）：上海雷勃分析儀器有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備抗原

西馬特羅半抗原合成見(jiàn)圖1。

圖1 西馬特羅半抗原合成Fig.1 Synthesis of cimaterol hapten

（1）制備半抗原

a：取芐腈-4乙酰基-2-氨1.0 g，加60 mL三氯甲烷溶解，加溴化銅1.41 g，加熱回流反應(yīng)4 h，停止反應(yīng)，加水50 mL，振蕩，靜置分層，分去水相，有機(jī)相蒸干，正己烷∶二氯甲烷（3∶1，V/V）70 mL，重結(jié)晶，得到α-溴代-3-氰基-4-氨基苯乙酮1.3 g，收率87.25%。

b：取α-溴代-3-氰基-4-氨基苯乙酮1.3 g，加乙腈80 mL溶解，加KOH 0.46 g，碘化鈉0.21 g，攪拌，加4-氨基-4-甲基戊酸0.86 g，加熱，回流反應(yīng)12 h，停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙腈，加水80 mL，加1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，乙酸乙酯100 mL×3，萃取3次，合并有機(jī)相，濃縮蒸干，二氯甲烷∶環(huán)己烷（1∶3，V/V）90 mL重結(jié)晶，得到丙酸西馬特羅酮基中間產(chǎn)物1.2 g，收率76.4%。

c：取丙酸西馬特羅酮基中間產(chǎn)物1.2 g，加甲醇60 mL溶解，冷卻至0～5 ℃，在攪拌下，加硼氫化鈉0.31 g，攪拌2 h，停止反應(yīng)，恢復(fù)至室溫，旋蒸，除去甲醇，加水100 mL，加1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6，加100 mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相水洗，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷∶甲醇（10∶1，V/V）洗脫分離，得到丙酸西馬特羅半抗原產(chǎn)物0.91 g，收率75.8%[16-19]。

（2）制備免疫原

取丙酸西馬特羅半抗原產(chǎn)物5.8 mg，加二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）1 mL溶解，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）11 mg，N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）7 mg，室溫反應(yīng)2 h，得到半抗原活化液A液；取血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）20mg，加3 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃反應(yīng)8 h，0.02 mol/L PBS透析純化72 h，透析袋截留分子質(zhì)量為8～14 kDa，每天換液3次，得到西馬特羅-KLH偶聯(lián)物免疫原，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）制備包被原

取丙酸西馬特羅半抗原產(chǎn)物6.4 mg，加DMF 1 mL溶解，加EDC 13 mg，加NHS 9 mg，室溫反應(yīng)2 h，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白（ovalbumin，OVA）50 mg，加6 mL PBS緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，透析純化、保存等方法同上述免疫原。

1.3.2 制備酶標(biāo)記抗體

將免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，獲得抗血清。測(cè)定小鼠血清效價(jià)，效價(jià)結(jié)果達(dá)到1∶2 000～1∶1 000，取小鼠脾細(xì)胞，按照8∶1的配比和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定細(xì)胞上清液，進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選。通過(guò)有限稀釋法克隆化陽(yáng)性孔，從而得到能夠分泌西馬特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用凍存液將單克隆雜交瘤細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液，按照0.5 mL/只的滅菌石蠟油劑量注入Balb/c小鼠腹腔，一周后，按照5×105個(gè)/只的劑量向腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，一周后可采集腹水。可通過(guò)辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水。將1.3.1得到的鼠源抗體免疫無(wú)病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體[20]，利用過(guò)碘酸鈉法，將其與辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)[21]，得到酶標(biāo)記抗抗體。

1.3.3 優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標(biāo)板

測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，抗原稀釋倍數(shù)依次為：1∶1 000，1∶3 000，1∶9 000；單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為：1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000，1∶160 000；酶標(biāo)記抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1 000。按照下列公式計(jì)算0、0.1 μg/L質(zhì)量濃度的西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率：

將100 μL抗原包被液（pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液）包被于酶標(biāo)板中，37 ℃孵育2 h，清洗酶標(biāo)板之后，加入150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的0.02 mol/L PBS，37 ℃孵育2 h，即制備完成酶標(biāo)板。

1.3.4 樣本的前處理方法

取50 mL 清亮豬尿樣直接測(cè)定（如尿樣渾濁必須通過(guò)過(guò)濾或室溫3 000×g以上離心10 min 直至清亮）。

1.3.5 酶標(biāo)板檢測(cè)

依次加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品50 mL/孔，酶結(jié)合物工作液50 mL/孔，避光反應(yīng)，洗滌干凈，再加入顯色液顯色，避光反應(yīng)后加入終止液，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處，測(cè)定每孔吸光度值（OD450nm值）。

1.3.6 計(jì)算樣本中西馬特羅含量

以西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率（y）為縱坐標(biāo)，繪制西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將樣本的OD450nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到相應(yīng)的濃度，該濃度乘以稀釋倍數(shù)即能計(jì)算出樣本中西馬特羅殘留量。

1.3.7 檢測(cè)性能

（1）計(jì)算檢測(cè)限

取20份空白豬尿樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算試劑盒的檢測(cè)限（limit of detection，LOD），檢測(cè)限指該檢測(cè)方法可檢測(cè)出的最低被測(cè)物濃度[17]。

（2）準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)樣本添加西馬特羅，使其質(zhì)量濃度分別達(dá)到0.5μg/kg、1.0 μg/kg和2.0 μg/kg，測(cè)定添加回收率，用以評(píng)價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度。同時(shí)，每個(gè)樣本做4個(gè)平行，按照上述1.3.3制備3批酶標(biāo)板，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），用以評(píng)價(jià)試劑盒的精密度。

（3）穩(wěn)定性的測(cè)定

測(cè)定試劑盒在不同溫度條件下的穩(wěn)定性，將試劑盒存儲(chǔ)于4 ℃條件下，每個(gè)月測(cè)定最大吸光度值（0 μg/L）、半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值、樣本的回收率等性能指標(biāo)，連續(xù)測(cè)定12個(gè)月。

（4）抗體特異性的測(cè)定

選擇西馬特羅的同類藥物或結(jié)構(gòu)類似物：溴布特羅、克倫特羅、溴氯布特羅、塞布特羅、馬布特羅、克倫潘特、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫巴胺、特布他林、妥布特羅、馬噴特羅、氯丙那林、羥甲基克倫特羅、噴布特羅、鹽酸班布特羅、菲諾特羅、齊帕特羅，測(cè)定藥物的IC50值，根據(jù)下式計(jì)算該試劑盒對(duì)上述藥物的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測(cè)定質(zhì)量濃度為0 μg/L和0.1 μg/L的西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗原、抗體的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of antigen and antibody

由表1可知，按照抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)的選擇方法[22]，即選擇OD450nm值（0.1 μg/L）/OD450nm值（0 μg/L）的抑制率在70%～85%范圍內(nèi)，并且抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明，本研究應(yīng)選擇的抗原稀釋倍數(shù)為3 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為80 000。

2.2 西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（C）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率（y）為縱坐標(biāo)，繪制西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of cimaterol

由圖2可知，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0～8.1 μg/L，半抑制濃度IC50值為0.870 μg/L；標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=-1.4736x+1.1476，相關(guān)系數(shù)為R2為0.994，表明二者線性關(guān)系良好。

2.3 方法檢出限

本研究對(duì)空白樣本的檢出限測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該檢測(cè)方法檢測(cè)限為0.295 μg/L。目前，檢測(cè)西馬特羅的方法主要是儀器方法，羅奕銘[23]建立了一種新型瘦肉精多殘留膠體金檢測(cè)卡的研制方法，對(duì)尿液中西馬特羅的靈敏度為5 μg/L。張連明等[24]建立了一種西馬特羅分子印跡熒光檢測(cè)試紙條的研制方法，最低檢測(cè)限為0.01 μg/mL。而本方法對(duì)豬尿中西馬特羅的檢出限為0.295 μg/L，優(yōu)于上述指標(biāo)。

表2 空白樣本檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Table 2 Determinationresultsof detection limit of blank samples μg/L

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)含有不同濃度西馬特羅的豬尿樣本進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，該檢測(cè)方法回收率范圍是81.5%～103.5%，批內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%～11.1%；批間精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.6%～8.1%，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度及精密度良好。

表3 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and accuracy tests

2.5 方法穩(wěn)定性

表4 試劑盒在4 ℃保存的穩(wěn)定性Table 4 Stability of the kit stored at 4 ℃

續(xù)表

由表4可知，當(dāng)試劑盒存儲(chǔ)于4 ℃時(shí)，試劑盒的最大吸光度值（0 μg/L）范圍是1.67～1.89，50%抑制濃度（IC50值）的范圍是0.521～0.886 μg/L，回收率范圍是84.2%～105.9%。綜上可知，當(dāng)試劑盒存儲(chǔ)于4 ℃時(shí)，12個(gè)月內(nèi)各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，即該試劑盒在4 ℃條件下至少能夠保存12個(gè)月。

2.6 方法抗體特異性

西馬特羅抗體與溴布特羅、克倫特羅、溴氯布特羅、塞布特羅、馬布特羅、克倫潘特、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫巴胺、特布他林、妥布特羅、馬噴特羅、氯丙那林、羥甲基克倫特羅、噴布特羅、鹽酸班布特羅、菲諾特羅、齊帕特羅的交叉反應(yīng)率結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of cross reaction rate tests

由表5可知，西馬特羅抗體與溴布特羅的交叉反應(yīng)率為22%，克倫特羅、溴氯布特羅的交叉反應(yīng)率為14%，塞布特羅、馬布特羅、克倫潘特的交叉反應(yīng)率10%，沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫巴胺、特布他林、妥布特羅、馬噴特羅、氯丙那林、羥甲基克倫特羅、噴布特羅、鹽酸班布特羅、菲諾特羅、齊帕特羅的交叉反應(yīng)率＜1%。可能由于免疫得到的西馬特羅抗體與西馬特羅的同類藥物或結(jié)構(gòu)類似物匹配度不同，因此導(dǎo)致了交叉反應(yīng)率存在差異。結(jié)果表明，西馬特羅抗體特異性良好，能夠排除大多數(shù)同類藥物或結(jié)構(gòu)類似物的干擾。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)制備西馬特羅人工抗原免疫小鼠，得到了抗西馬特羅單克隆抗體，將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒的研制，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0～8.1 μg/L，對(duì)豬尿中西馬特羅的檢測(cè)限為0.295 μg/L，回收率為81.5%～103.5%，批內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～11.1%；批間精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.6%～8.1%，表明該方法準(zhǔn)確度及精密度良好。西馬特羅單克隆抗體的特異性較好酶聯(lián)免疫試劑盒在4 ℃能夠儲(chǔ)存12個(gè)月，穩(wěn)定性較好[25]，能夠?qū)υ撍幬飳?shí)現(xiàn)快速、便捷的低成本檢測(cè)。