市售生鮮濕面中腐敗菌的分離與鑒定

王 歡，李剛鳳，夏欣欣，馬莉敏，吳興泉*

（1.河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.銅仁學院 材料與化學工程學院，貴州 銅仁 554300）

生鮮濕面是指經一系列加工工藝制成的未經殺菌及防腐劑處理的面條[1]，其營養豐富[2]、口感筋道[3]、食用方便、耐煮性好、便于攜帶，深受消費者青睞。由于生鮮濕面水分含量[4]較高，容易滋生腐敗微生物，導致保藏期短[5]，嚴重制約了生鮮濕面[6]大規模商業化生產的品質[7]，這一直是阻礙生鮮濕面工業化生產的嚴重問題[8]。

中原地區主要以面食為主，生鮮濕面在河南地區尤為暢銷，為近一步提高生鮮濕面的最佳保質期和食用品質，對生鮮濕面的腐敗菌群進行深入分析具有重要的意義。周文化等[9]對室溫下存放48 h的生鮮濕面進行菌相分析，發現引起生鮮濕面腐敗的微生物主要是毛霉和青霉；肖付剛等[10]對28 ℃條件下保存的生鮮濕面的微生物種群進行分離鑒定，研究發現引起生鮮濕面腐敗變質的細菌是芽孢桿菌屬（Bacillussp.）和葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）。目前，河南地區主要研究方向集中在通過生鮮濕面的加工工藝優化[11]及化學保鮮劑[12-13]的處理延長生鮮濕面保質期，并未對河南地區生鮮濕面中的腐敗菌進行分離鑒定。河南高溫高濕、雨熱同期的氣候特點使生鮮濕面儲存運輸過程微生物的變化受到氣候條件的影響較大，易出現菌落總數超標現象導致變質[14]。

因此，本研究擬采用涂布平板法對鄭州市售生鮮濕面中的腐敗菌進行分離，通過形態觀察及分子生物學技術對分離腐敗菌進行菌種鑒定，為針對抑制生鮮濕面中腐敗菌提供理論參考，以期為生鮮濕面的產業發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

生鮮濕面：購于鄭州市中原區5個不同市場，每個市場3個批次，每批次3個重復樣本。

1.1.2 試劑

瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨（均為生化試劑）、葡萄糖、蔗糖、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；硝酸鈉（分析純）：中國（鄭州）派尼化學試劑廠；通用引物（ITS1/ITS4）和（27F/1492R）：派森諾生物基因科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基[2]：酵母浸出物2.5 g，葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，15%氫氧化鈉2 mL，調制pH值至7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基[2]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃，高壓蒸汽滅菌15 min。

高鹽察氏培養基[2]：硝酸鈉2 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，NaCl 6 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

LB培養基[2]：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

ABI-2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；Mini Pro 300V Power Supply major science電泳儀：美國Major Science公司；ABI 3730XL測序儀：美國Applied Biosystems公司；QL-861旋渦振蕩器：江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠；SW-CJ-2D潔凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；Labnet Sub System 70電泳槽：美國Labnet公司；蔡司ZEISS primo star生物顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養箱：常州金壇精達儀器制造有限公司；Mixer 4K迷你渦旋混合器：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生鮮濕面的微生物計數

將包裝密封的生鮮濕面分別于25 ℃和37 ℃條件下貯藏，每24 h統計微生物菌落數，連續觀察72 h。菌落總數測定：參照GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》[15]；霉菌及酵母的測定：參照GB/T 4789.15—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數》[16]。

1.3.2 生鮮濕面中腐敗菌的分離純化

在無菌條件下，取25 ℃、37 ℃條件下培養48 h后的面條25 g于含225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，4 000 r/min振蕩2 min，采用無菌生理鹽水梯度稀釋至10-7。吸取上述37 ℃稀釋梯度為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液200 μL涂布于平板計數瓊脂培養基，于37 ℃條件下培養48 h，用于分離腐敗細菌；吸取上述25 ℃稀釋液200 μL涂布于PDA培養基，25 ℃條件下培養48 h后，挑取單菌落接種于高鹽察氏培養基，于25 ℃條件下培養48 h，用于分離腐敗霉菌，每個稀釋度3個平行。同時，吸取200 μL無菌生理鹽水稀釋液涂布于不同培養基作空白對照，每個不同培養基3個平行。從平板計數瓊脂、PDA培養基及高鹽察氏培養基中選取典型生長的單一菌落，反復分離純化，鏡檢，得到純菌株4 ℃保藏。

1.3.3 生鮮濕面中腐敗菌的形態學鑒定

菌落形態觀察：觀察單菌落的大小、形態、顏色、質地、邊緣、表面紋飾等。細胞形態觀察：霉菌挑取48 h培養物，細菌挑取24 h培養物制成載片標本，觀察細胞形態和排列方式等。霉菌的形態學鑒定實驗方法參考GB/T4789.16—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗常見產毒霉菌的鑒定》[17]，細菌的形態學鑒定實驗方法參考《一般細菌常用鑒定方法》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》[19]。

1.3.4 生鮮濕面中腐敗菌的分子生物學鑒定

挑取培養48 h的單菌落分別轉至LB培養基和PDA培養基中，分別于25 ℃、37 ℃培養24 h，采用真菌和細菌基因組提取試劑盒提取待測菌株的DNA，以其為模板，采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對真菌的ITS rDNA基因序列進行PCR擴增；采用通用引物27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'）對細菌的16S rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：基因組DNA（20 ng/μL）1 μL、10×Buffer（含2.5 mol/L Mg2+）5.0 μL、rTaq聚合酶（5 U/μL）1.0 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）1.0 μL、正反引物各1.5 μL，加雙蒸水至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，35個循環；72 ℃再延伸7 min，4 ℃終止反應。取5 μLPCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將獲得的PCR擴增產物條帶送至上海派森諾基因科技有限公司進行測序。測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行序列比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS rDNA或16S rDNA基因序列，使用MEGA10軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 生鮮濕面的微生物計數

包裝密封的生鮮濕面在貯藏過程中，菌落總數、霉菌、酵母菌的變化規律見表1。

表1 貯藏過程中生鮮濕面中微生物生長情況Table 1 Growth of microorganisms in fresh wet noodles during storage

由表1可知，隨貯藏時間的延長，生鮮濕面中微生物的數量逐漸增多，當25 ℃條件下儲藏72 h時，菌落總數已經達到1.6×106CFU/g。根據NY/T 1512—2014《綠色食品 生面食、米粉制品》[20]微生物學指標規定菌落總數≤3×105CFU/g，生鮮濕面在25 ℃條件下的貨架期僅為48 h。生鮮濕面水分含量較高，營養豐富等特點為霉菌和酵母的生長提供了有利環境，河南高溫高濕的氣候特點加速了腐敗細菌的生長，導致生鮮濕面貨架期較短。

2.2 生鮮濕面中霉菌的分離及鑒定

從高鹽察氏培養基中選取3株典型的霉菌進行反復劃線分離培養，編號分別為A1、B1、C1，其菌落形態和個體形態特征見圖1，特征描述見表2。

圖1 菌株A1、B1、C1的菌落形態及個體形態特征Fig.1 Colonial morphology and individual morphology characteristics of strains A1,B1 and C1

表2 菌株A1、B1、C1的菌落形態及個體形態特征描述Table 2 Description of colony and individual morphology characteristics of strains A1,B1 and C1

由圖1及表2可知，根據GB/T 4789.16—2016《食品安全國家標準食品衛生微生物學檢驗常見產毒霉菌的鑒定》[17]初步鑒定菌株A1和B1均為曲霉屬（Aspergillussp.）、菌株C1為青霉屬（Penicilliumsp.）。進一步采用分子生物學技術對3株霉菌進行鑒定，其系統發育樹見圖2。

圖2 基于ITS rDNA基因序列菌株A1、B1及C1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1,B1 and C1 based on ITS rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株A1與黃曲霉（Aspergillus flavus）聚于一支，親緣關系最近，菌株B1與黑曲霉（Aspergillus niger）聚于一支，親緣關系最近，菌株C1與草酸靑霉（Penicillium oxalicum）聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察，將菌株A1、B1、C1分別鑒定為黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、草酸靑霉（Penicillium oxalicum）。

霉菌在自然界中分布廣泛，特別是糧油食品中。宋顯良等[21]利用霉菌菌落表征與顯微鏡鏡檢從生鮮濕面中初步判定鮮濕面貨架期內霉點出現和霉味產生是毛霉和青霉引起的。黃曲霉及黑曲霉產生的次級代謝產物黃曲霉毒素，真菌毒素不僅會污染食品，而且會對人類的健康產生嚴重危害[22]。在生鮮濕面生產前期應嚴格把控原料中黃曲霉毒素含量，嚴格控制原料儲存溫度、濕度、水分含量等因素，限制黃曲霉及黑曲霉的生長，防止因毒素污染造成的損失。

2.3 生鮮濕面中細菌的分離及鑒定

從PCA培養基中反復劃線分離出5株菌，編號分別為S1、S2、S3、S4、S5。通過革蘭氏染色鏡檢發現，菌株S1、S3、S4、S5均為革蘭氏陽性細菌，而菌株S2為革蘭氏陰性細菌。5株細菌的菌落形態見圖3，菌落形態特征描述見表3。

由圖3及表3可知，根據《一般細菌常用鑒定方法》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》[19]，初步鑒定菌株S1、S3、S4、S5為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），菌株S2為沙門氏菌屬（Salmonellasp.）。進一步采用分子生物學技術對5株腐敗細菌進行菌種鑒定，其系統發育樹見圖4。

圖3 5種腐敗細菌的菌落形態Fig.3 Colonial morphology of 5 strains of spoilage bacteria

表3 5種腐敗細菌菌落形態特征描述Table 3 Description of colonial morphology of 5 strains of spoilage bacteria

圖4 基于16S rDNA基因序列5種腐敗細菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 5 strains of spoilage bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株S1、S4、S5與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）聚于一支，親緣關系最近，菌株S2與腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）聚于一支，親緣關系最近，菌株S3與副芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察結果，最終鑒定菌株S1、S4、S5為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株S2為腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica），菌株S3為副芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）。

3 結論

本研究對生鮮濕面中腐敗菌進行分離純化，得到3株典型霉菌A1、B1、C1和5株典型細菌S1、S2、S3、S4、S5，經形態觀察及分子生物學技術鑒定，結果表明，3株腐敗霉菌中菌株A1為黃曲霉（Aspergillus flavus），菌株B1為黑曲霉（Aspergillus niger），菌株C1為草酸靑霉（Penicillium oxalicum）；5株腐敗細菌中菌株S1、S4、S5為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株S2為腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica），菌株S3為副芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）。