大豆蛋白胨對粗糙脈孢菌3.1607產番茄紅素的影響及其發酵條件優化

郭月山，陳 鋼*，王瑞琪，簡素平，黃立山

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

番茄紅素是一種能夠中和多種氧化因子[1-2]的天然類胡蘿卜素[3]。研究發現番茄紅素對多種癌細胞[4-6]有抑制作用，并能防止人體胞內基因突變[7]。這些特性使番茄紅素在保健食品領域有很廣闊的市場。

番茄紅素的3種來源為直接提取[8]、化學合成[9]和微生物發酵[10]。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）作為一種常見真菌，其具有較高的產番茄紅素能力[11-12]，且不像三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）需要接種正負菌[13]，操作簡便，有作為工業發酵菌種的潛力。培養基成分對微生物發酵有很大影響，微生物生長情況及發酵產物的產量因為其組成成分的不同而變化。碳源、氮源、金屬離子等都對微生物發酵有影響[14-15]，而氮源的選擇與添加時間均對微生物發酵有明顯的影響。研究發現，單獨的氨基酸添加、植物性氮源代替動物性氮源等對氮源的改變都能夠不同程度的提高微生物次級產物的產量。三孢布拉氏霉（Blakesleatrispora）菌培養過程中，加入一定量氨基酸可以顯著增加番茄紅素產量[16]；王蓉等[17]研究發現不同的無機氮源可提高黏性紅酵母產番茄紅素產量；植物性氮源對肺炎雙球菌[18]、乳酸菌[19]的生長均有促進作用且植物蛋白相較于動物蛋白對某些微生物有更好的生長促進作用；分別對檸檬酸、ε-聚賴氨酸[20-21]發酵生產過程的研究證實，在發酵過程中添加相應氮源能有效提高產量。本研究研究了大豆蛋白胨在粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素過程中的影響，并對其發酵工藝進行優化，為粗糙脈孢菌發酵高產番茄紅素的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）3.1607，在-20 ℃下保藏于實驗室冰柜，采購于廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

谷氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸（均為分析純）、乙酸乙酯、丙酮色、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純）：西隴科學股份有限公司；番茄紅素標準品（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

種子培養基：即馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯浸出粉12 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂14 g/L，pH 5.6。

基礎發酵培養基：葡萄糖18 g/L，蛋白胨12 g/L，NaNO31.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.24 g/L，KCl 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.006 g/L，K2HPO40.6 g/L，加蒸餾水制成1 L培養液，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

TS-1210B型恒溫搖床：蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；SW-CJ-1B標準凈化工作臺：蘇州凈化儀器廠；LC-100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌體懸液制備

將100 mL蒸餾水的錐形瓶滅菌后接入30 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化的孢子，制成6×105CFU/mL的孢子懸液，置于無菌操作臺中備用。

1.3.2 搖瓶培養[22]

將50 mL培養基置于錐形瓶，接入菌懸液，移入搖床培養箱中100 r/min培育19 h，后靜置培養87 h，共培養106 h，全程光照，溫度恒定在30 ℃，每次進行3組平行實驗，所有試驗均以該條件培養。

1.3.3 生物量測定

將菌體從錐形瓶中取出，蒸餾水沖洗后抽濾，獲得的菌體于烘箱中50 ℃下烘干48 h至質量恒定，使用分析天平稱量。

1.3.4 番茄紅素的測定

番茄紅素提取[23]：細磨加入了石英砂的干燥菌體，置入10 mL乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V），于200 W，40 kz，30 ℃超聲處理20 min后在33 ℃水浴鍋中暗室浸提2.5 h。上層清液以6 000 r/min離心10 min，經過0.22 μm濾膜去除雜質即可，每組制備3個平行組，進行HPLC檢測。

HPLC色譜檢測條件[24]：色譜柱為Agilent Ecllpse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相采用乙腈-二氯甲烷（3∶2，V/V），檢測波長472 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

制作番茄紅素標準曲線[25]：以乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V）為溶劑，稱取番茄紅素標品制備質量濃度為100 μg/mL的溶液。稀釋溶液為0、10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、90 μg/mL、100 μg/mL的標準溶液。以色譜條件作定性分析，得到各個梯度的吸收峰面積，以質量濃度為縱坐標（Y），峰面積為橫坐標（X）進行標準曲線線性回歸計算，得到番茄紅素標準品回歸方程：Y=24.933X+10.719（R2=0.9987）。

1.3.5 單因素試驗設計

大豆蛋白胨添加量：在加入大豆蛋白胨、添加時間為53 h、接種量6%的條件下，探究添加量分別為0、2 g/L、6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L時對番茄紅素產量的影響。

大豆蛋白胨添加時間：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接種量為6%的條件下，探究大豆蛋白胨添加時間分別為11 h、25 h、39 h、53 h、67 h對番茄紅素產量的影響。

菌種接種量：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接種時間為6%的條件下，探究接入2%、3%、4%、5%、6%、7%的菌種時對番茄紅素產量的影響。

1.3.6 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加時間（B）、接種量（C）為自變量，番茄紅素產量（D）為響應指標進行響應面試驗（response surface methodology，RSM）設計，RSM因素與水平見表1。

表1 蛋白胨添加條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for peptone addition conditions optimization

1.3.7 數據分析

Design Expert 8.0.6軟件分析數據，所得結果均為3次平行測定均值，Origin 8.5制作單因素試驗圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 大豆蛋白胨添加量優化

圖1 大豆蛋白胨添加量對粗糙脈孢菌產番茄紅素的影響Fig.1 Effect of soybean peptone addition on lycopene yield by Neurospora crasa

由圖1可知，添加了大豆蛋白胨后，粗糙脈孢菌的干質量和番茄紅素產量都有一個明顯的提高。干質量隨著添加量的增加而增加，說明大豆蛋白胨促進了菌體的發育。當添加量達到6 g/L時菌體干質量增加明顯放緩，可能是因為此時菌體密度過于稠密，限制了菌體的繼續發育，從而導致干質量增長放緩。番茄紅素產量隨大豆蛋白胨的量增加而獲得提升，為10 g/L時達到頂峰；在大豆蛋白胨＞10 g/L時產量降低，產量隨大豆蛋白胨的增加而減少，一方面可能是因為孢子生長減緩，擴增受到限制，另一方面可能是因為大豆蛋白胨過量，分解的肽段過多促進了菌體菌絲的生長，造成了光的誘導作用減弱，造成了產量下降。故蛋白胨最佳添加量為10 g/L。

2.1.2 大豆蛋白胨添加時間優化

圖2 大豆蛋白胨添加時間對粗糙脈孢菌產番茄紅素的影響Fig.2 Effect of soybean peptone addition time on lycopene yield by Neurospora crasa

由圖2可知，在39 h之前，粗糙脈孢菌干質量隨大豆蛋白胨添加時間的增加而相應提高，當到達39 h時干質量達到頂峰，之后干質量隨著添加時間的增加而減少。這可能是因為培養的11～53 h期間是粗糙脈孢菌的對數生長期，此時加入大豆蛋白胨主要為粗糙脈孢菌補充菌體生長發育所需的肽段[26]，促進粗糙脈孢菌的快速增殖，增加干質量。在53 h之前，番茄紅素的產量隨著添加時間的增加而相應提高。添加時間為53 h時，番茄紅素產量達到峰值，之后產量下降。可能因為53 h左右時菌體開始進入穩定期，此時次級產物開始大量合成，這時加入的大豆蛋白胨主要為菌體提供了必要的氨基酸等合成次級產物的基礎物質，促進了次級代謝產物番茄紅素的合成，因此產量也增加。在53 h之后加入大豆蛋白胨，因為已有番茄紅素的影響同時有的番茄紅素開始合成β-胡蘿卜素這一下級產物，添加后番茄紅素前體的增多相應促進了下一級產物的合成，因此產量減少。故大豆蛋白胨的最佳添加時間為53 h。

2.1.3 菌種接種量優化

由圖3可知，粗糙脈孢菌的干質量隨著接種量的增大而先升高后降低。接種量5%時，干質量達到峰值，可以看出菌體干質量受到的影響有限，可能是因為所用錐心瓶容積有限，生長時菌體受空間限制無法更多生長。接種量＜6%時產量隨接種量增加而提高，之后下降，可能因為接種量＞6%時，菌絲生長過于茂盛，使培養液的渾濁度過高，影響了光照對菌體番茄紅素的誘導作用最終導致產量的下降。故最佳接種量為6%。

圖3 接種量對粗糙脈孢菌產番茄紅素的影響Fig.3 Effect of inoculum on lycopene yield by Neurospora crasa

2.2 響應面法優化大豆蛋白胨添加條件

2.2.1 響應面試驗結果與分析

根據2.1中所得試驗結果，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加時間（B）和菌種接種量（C）作為自變量，番茄紅素產量（D）作為響應值進行響應面試驗設計。響應面試驗設計及結果見表2。

表2 大豆蛋白胨添加條件優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology for soybean peptone addition conditions optimization

2.2.2 模型建立與方差分析

對表2的試驗結果進行處理分析，最后得到了響應值番茄紅素產量（D）對編碼自變量A、B、C的方程預測模型為：

方差分析結果見表3。結果中的F值大小及P值大小表示表2結果數據是否顯著。一般來說，F值越大，對應數據越顯著；P值越小，對應數據越顯著。如表3所示，模型的F值為141.50（P＜0.0001），具有非常高的顯著性，同時可以看到，失擬項的F值為1.84（P＞0.05）表現為不顯著，說明模型不能使用的可能性低，模型良好。模型決定系數R2=0.9945，表示模型變化來源于自變量的比例，表明模型響應值的變化99.45%來自所選自變量，另外存在0.55%的總變異無法采用此模型解釋，極低的變異比例說明模型能較好的解釋結果。校正決定系數R2adj=0.987 5，信噪比=34.02＞4，說明模型擬合度良好。其中因素A和B、二次項A2、B2對產量影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對產量影響顯著（P＜0.05）。由系數值A=0.64，B=0.26，C=0.059，可知因素的主效應關系為：大豆蛋白胨添加量＞添加時間＞接種量。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

2.2.3 各因素間相互作用

如圖4a所示，大豆蛋白胨添加量和添加時間之間對粗糙脈孢菌番茄紅素產量影響顯著，存在最高點[27]，即大豆蛋白胨添加量在10～12 g/L之間、添加時間在53～60 h之間時，番茄紅素的產量達到最高。而觀察圖4b、4c可以明顯發現AC、BC的響應面圖不形成閉環，且從表3可以發現，兩者P值均＞0.05，其交互作用不顯著。依據所得數據，結合已計算出的實驗方程，分析獲得的最佳發酵條件如下：大豆蛋白胨添加量10.80 g/L，添加時間55.27 h，接種量6.17%，添加后培養50.73 h，預測番茄紅素產量達到最大值9.65 mg/L。

圖4 各因素交互作用對番茄紅素產量影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on lycopene yield

2.2.4 驗證試驗

為了便于實際操作，將理論最佳發酵條件修正為：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加時間55 h，接種量為6%，添加蛋白胨后繼續培養51 h。經過3次重復試驗檢驗，獲得的番茄紅素產量實際值為（9.64±0.15）mg/L，此結果與預測值基本吻合，沒有明顯差異。

3 結論

本實驗研究了大豆蛋白胨對粗糙脈孢菌產番茄紅素的影響，確定了大豆蛋白胨對粗糙脈孢菌產番茄紅素有明顯影響。結合單因素與響應面法優化了大豆蛋白胨添加量、添加時間及菌種接種量因素，影響因素順序依次為：大豆蛋白胨添加量＞添加時間＞接種量。最佳發酵工藝條件為：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加時間55 h，接種量6%，添加蛋白胨后繼續培養51 h。此優化條件下，番茄紅素的產量為9.64 mg/L。