不同連接肽在硫酸軟骨素酶ABC I重組表達中的應用研究

李 曄，陳振婭，王瑞麗，沈 榮，危 晴，陳 亮

（1.北京電子科技職業學院 生物工程學院，北京 100176；2.北京理工大學 生命學院，北京 100081）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是糖胺多糖的一種，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過β-1,3糖苷鍵相結合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類大分子多糖，雙糖單位數目一般在50～70個，分子質量約在5～50 kDa之間。糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，主要分布在細胞外基質和細胞表面，用來指導很多生物過程，如細胞增殖、信號傳輸和炎癥介導等[1-3]。

硫酸軟骨素酶（chondrotinase，ChSase）是一類能將糖胺聚糖催化裂解為小分子多糖的酶，ChSase根據其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等類型。盡管CS已有很多的藥效，但小分子的CS藥效更為顯著。小分子的硫酸軟骨素（CS），以硫酸軟骨素為主體構成的可聚蛋白聚糖在軟骨基質中起著一種“分子彈簧”的作用，具有止痛，促進軟骨再生的功效，可從根本改善關節問題。ChSase ABC還具有緩解視網膜變性[4]，提高后肢運動能力[5]，降解囊性纖維變性部位的黏液物，緩解突出椎間盤癥狀[6-8]。另外，LEE M C等[9]研究發現，當軟骨用ChSase ABC處理后，移植的軟骨細胞與軟骨創面的黏附能力大大增強。

ChSase ABC分為I和II，ChSase ABC I的晶體結構與ChSase ABC II相似，主要包含三個主要的區域，N-端區域有雙層的β-折疊，催化區域有雙層的（α/α）5的折疊和C-端的反平行β-折疊區域[10]，ChSase ABC I在相同底物的作用下催化效率比ChSase ABC II高，ChSase ABC I的米氏常數（Km）比ChSase ABC II低，最大反應速率（Vmax）比ChSase ABC II高[11]。

ChSase ABC I由997個氨基酸殘基構成，ChSase ABC II由990個氨基酸殘基構成[11]。通過重原子置換法和多波長反常散射法技術分析，ChSase ABC I在1.9? 的分辨率下R因子和自由R因子分別為0.157和0.214，具有很好的立體化學性[12]。ChSase ABC I的N端是由1～210位的氨基酸構成的雙層β折疊和一個短的α螺旋，該區域的氨基酸序列與裂解碳水化合物酶相似，如木聚糖酶和一些凝集素。中間區域是由211～593位氨基酸構成的15個α螺旋，是主要的催化區域。C端是由594～997位氨基酸構成的4個反向平行的β折疊，氨基酸序列與ChSase AC酶的C端有21%的相似性，與肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的透明質酸酶有17%～19%的相似性，ChSase ABC I的C端氨基酸的主要作用是裂解CS A、CS C 和透明質酸[13]。

ChSase ABC II的晶體結構與ChSase ABC I非常相似，主要包含3個主要的區域，N端是由14～170位的氨基酸構成的雙層β折疊，且Ca2+結合在第二和第三個β鏈之間。中間區域是由171～593位氨基酸構成的雙層的（α/α）5折疊，與ChSase AC，透明質酸裂解酶，黃原膠裂解酶和肝素酶II相似，有一個與底物結合區域。C端是由594～1 014位氨基酸構成的4個反向平行的β折疊[12，14]。與ChSase AC結構對比后，推測其活性位點為His454，Tyr461，Arg514和Glu628，同樣通過定點突變實驗驗證了推測結果[15]。

目前也有許多關于ChSase ABC的固定化和穩定性的研究，但是這些酶大多都是從菌株中分離得到，分離步驟繁瑣，且得到的酶活較低，酶的主要來源為彭氏變形桿菌（Proteus penneri）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），酶活為0.3 U/mL和0.9 U/mL[16-20]。目前重組菌構建越來越受到關注，ChSase ABC重組菌也越來越多，但是仍然面臨著許多的困難：一方面通過菌體表達得到的重組酶，多數都以包涵體形式表達，再經過后續的包涵體分離純化及復性，得到的酶量有限。另一方面ChSase ABC的分離純化，常用的是硫酸銨沉淀法，這種方法的成本很高，是制約酶工業化生產的主要瓶頸。融合蛋白主要由兩部分組成，即功能蛋白和連接肽。功能蛋白為所要融合的具有特定功能活性的原始蛋白，通常結構功能已知，選擇上不存在困難。而連接肽由于其在融合蛋白整體結構中的重要性，在選擇和設計上需要加以研究思考[21-23]，從而確保融合蛋白的整體活性不變[24]。因此，本研究選用兩種連接肽與目的蛋白進行融合，首次將來源于普通變形桿菌（Proteus vulgaris）KCTC 2579的ChSase ABC I與麥芽糖結合蛋白（maltose binging protein，MBP）分別用FFFFF和RRRRR兩種連接肽連接，并克隆到pMAL-c2X載體上，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）高效表達，并且利用直連淀粉柱實現了一步純化，并探究了這兩種柔性和剛性連接肽在ChSase ABC I表達中的影響。為該酶的基因改造提供一種新手段，為酶的性質優化和工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通變形桿菌（Proteusvulgaris）KCTC2579：韓國KCTC保藏中心；E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）感受態細胞：北京博邁德生物技術有限公司；pMAL-c2x：本實驗室保存；FFFFF、RRRRR：北京普爾普樂生物技術有限公司合成；Q5TMHigh-Fidelity 2×Master Mix、T4連接酶和所有的限制性內切酶：New England Biolabs公司；硫酸軟骨素A（分子質量為50 000）：南京奧多福尼生物科技有限公司；細菌全基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒：美國OMEGA公司；其他試劑均國產分析純。

Proteus vulgarisKCTC 2579采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏提取物0.3%，蛋白胨0.5%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

大腸桿菌培養采用LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

全合成的RRRRR基因序列為：5'-GTCGATGAAGCC CTGAAAGACGCGCAGACTGAGGCTGCCGCAAAGGAA GCGGCAGCGAAAGAGGCGGCCGCAAAAGAGGCAGC GGCGAAAGAAGCTGCGGCCAAGCTCGAGGCCACCAG CAATCCTGCATTTGATCCTAAAAATC-3'

全合成的FFFFF基因序列為：5'-CTGTCGATGAAGC CCTGAAAGACGCGCAGACTGGTGGTGGCGGCAGCGG TGGCGGCGGTAGCGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGG TGGTTCTGGTGGTGGTGGCAGCCTCGAGGCCACCAG CAATCCTGCATTTGATCCTAAAAATCTGAT-3'

1.2 儀器與設備

1-14K離高速冷凍離心機：美國Sigma公司；MBPTrapHP親和柱（1 mL）：美國GE Healthcare公司；HT-400B恒溫培養箱：上海赫田科學儀器有限公司；ZQZY-78AV搖床：上海知楚儀器有限公司；DYCP-31CN型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；165-8001蛋白電泳儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I的構建

將ProteusvulgarisKCTC2579從安培管中接入到牛肉膏蛋白胨培養基，37 ℃靜置培養72 h，菌體12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用OMEGA公司細菌全基因組提取試劑盒提取基因組，以此為模板，并采用Q5TMHigh-Fidelity2×Master Mix對ChSase ABC I進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。根據已知的ChSase ABC I基因序列（GenBank：GQ996964.1）設計PCR引物，ChSase ABC I-F：5'-GCCACCAGCAATCCTGCATTTGATCCTAAA-3'，ChSase ABC I-R：5'-AGAGGATCCGAATTCTTATCAAGGGAGTGGCGAGAGTTTGATTTCT-3'。以pMAL-c2x為模板，以MBP-F：CCGTTTAGGTGTTTTCACGA，MBP-R：AGTCTGCGCGTCTTTCAGGG為引物，PCR獲得MBP基因。

以MBP、FFFFF、ChSase ABC I 為模板，MBP-F/ChSase ABC I-R為引物，PCR 擴增得到MBP-FFFFF-ChSase ABC I基因；以MBP，RRRRR，ChSase ABC I 基因為模板，MBP-F/ChSase ABC I-R為引物，PCR擴增得到MBP-RRRRR-ChSase ABC I基因。

將擴增得到的MBP-FFFFF-ChSaseABCI，MBP-RRRRRChSase ABC I和pMAL-c2x基因均用NdeI/EcoRI酶切，酶切后進行膠回收。然后用T4DNA連接酶進行連接，連接后轉化到E.coliDH5α，并進行菌落PCR，酶切和測序驗證。

1.3.2 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的表達

將重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I轉化到E.coliBL21（DE3）中，用接種環挑取一環菌體接種到預先滅菌的裝有4 mL LB培養基和100 μg/mL氨芐青霉素的試管中，37 ℃、180 r/min振蕩培養12 h后，作為種子液。按1%的接種量將種子液接到裝液量為50 mL/250 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養至對數生長中期（OD600nm值為0.6左右）。加入一定量異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）至濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、180 r/min誘導表達20 h。

1.3.3 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的純化

將誘導表達20 h后的菌，6 000 r/min條件下離心6 min，并用適量的水洗菌體。加入適量的Tris-HCl，pH 7.4緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體，超聲條件為：超聲5 s，間歇6 s，超聲功率0.3 kW，破碎總時間為15 min。破碎時要保證低溫破碎。破碎液離心后收集上清，并用0.22 μm濾膜過濾上清，過濾后置于冰上備用，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證蛋白大小。按照直鏈淀粉柱的說明書上的一步純化的方法進行親和分離純化。

1.3.4 酶活及酶比活測定

重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I 和MBP-RRRRRChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A為4,5-不飽和糖醛酸產物，此產物在232 nm波長處有強烈吸收，故通過在波長232 nm處測定吸光度值，計算重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活[25-26]。蛋白濃度測定采用Bradford法。

2 結果與分析

2.1 PCR結果驗證

PCR擴增得到MBP、ChSase ABC I、MBP-FFFFF-ChSase ABCI和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的基因見圖1。已知MBP基因片段的堿基長度為1 173 bp，ChSase ABC I基因片段的堿基長度為3 000 bp，RRRRR基因片段的堿基長度為145 bp，FFFFF基因片段的堿基長度為151 bp。所以可以計算得知，MBP-RRRRR-ChSaseABCI基因片段的堿基長度為4 318 bp，MBP-FFFFF-ChSase ABC I基因片段的堿基長度為4 324 bp。由圖1可知，PCR擴增得到的MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSaseABCI的堿基長度與預期一致，故PCR擴增已成功獲得MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的基因。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR結果Fig.1 Results of PCR verification by agarose gel electrophoresis

2.2 重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I的構建

連接轉化后獲得的陽性轉化子，通過提取質粒和酶切驗證，用NdeI/EcoRI酶切驗證重組質粒pMAL-c2x-FFFFFChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I，結果見圖2。由圖2可知，成功獲得5 473 bp和4 318 bp，5 473 bp和4 324 bp的基因片段，表明已成功獲得重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I。測序結果同樣表明已成功構建了重組質粒pMAL-c2x-FFFFFChSaseABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I。

圖2 重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I經Nde I/EcoR I酶切產物Fig.2 Enzyme-digested product of recombinant plasmids pMALc2x-FFFFF-ChSase ABC I and pMAL-c2x-RRRRRChSase ABC I by Nde I/EcoR I

2.3 重 組 酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I 和MBP-RRRRRChSase ABC I的表達

將重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I分別轉化到E.coliBL21（DE3）中，在相同的條件下誘導表達，結果見圖3。分別測定蛋白濃度，酶活力和酶比活，結果見表1。

圖3 重組質粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I裂解底物硫酸軟骨素A后的全掃描圖Fig.3 Full scan of chondroitin sulfate cracked by recombinant plasmid pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I

由圖3可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBPRRRRR-ChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A為4,5-不飽和糖醛酸產物，此產物在波長232 nm處有強烈吸收。結果表明，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I已成功表達，同樣方法驗證了重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I也成功表達。

表1 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I酶活、蛋白含量及比酶活Table 1 Activities,protein contents and specific enzyme activities of recombinases MBP-FFFFF-ChSase ABC and MBPRRRRR-ChSase ABC I

由表1可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為716.5 IU/L發酵液和1.15 IU/mg蛋白，重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為741.0 IU/L發酵液和1.13 IU/mg蛋白。剛性連接肽RRRRR的總酶活比柔性連接肽FFFFF的總酶活高。剛性連接肽RRRRR的菌體量、蛋白含量比柔性連接肽FFFFF的高。

2.4 SDS-PAGE驗證重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子質量

SDS-PAGE測定重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子質量，結果見圖4。由圖4可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I已在BL21（DE3）中成功表達，并且獲得了可溶性的重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I，上清液基本包含了90%以上的總蛋白。SDSPAGE結果表明，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBPRRRRR-ChSase ABC I的分子質量均為130 kDa。

圖4 SDS-PAGE驗證重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I分子質量Fig.4 Verification of molecular mass of recombinases MBP-FFFFFChSase ABC I and MBP-RRRRR-ChSase ABC I by SDS-PAGE

3 討論

本研究通過一步親和純化的方法獲得重組酶MBPFFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I。采用直連淀粉柱親和MBP實現一步純化，MBP可以與直鏈淀粉結合，從而吸附在直鏈淀粉柱上，再利用親和力更強的麥芽糖將MBP-HepC融合蛋白洗脫，利用此特性實現重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的親和純化。本研究表明直鏈淀粉柱能夠有效地吸附重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC，通過一步親和分離純化，目標蛋白的純度即可達95%以上，大大縮減了純化步驟并降低了分離純化成本。

ChSase ABC I的發展同樣還受到諸多因素的限制，需從以下幾方面入手來改變現狀，首先，需要尋找新型菌株，表達策略及代謝途徑來實現酶的高效分泌表達，避免后續的包涵體復性對酶活性的影響，實現其在工業化中的應用。其次，通過構建含有不同標簽的融合表達載體來實現酶快速和高效分離純化。最后，需研究新方法來增強酶的熱穩定性，延長酶的保藏時間，如尋找耐熱菌來源的ChSase ABC I等。另外，ChSase ABC I的固定化也是研究的一個重要方面，特別是在醫藥領域，如何找到能夠承載ChSase ABC I的合適的藥物載體，來協助其完成特定的藥效功能是亟待解決的問題。

4 結論

ChSaseABCI是一類能夠將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質酸等糖胺多糖降解為寡糖及不飽和二糖的裂解酶。本研究所用的ChSase ABC I基因來源于Proteus vulgarisKCTC 2579，首次將ChSase ABC I與麥芽糖結合蛋白分別用FFFFF和RRRRR兩種連接肽連接，并克隆到pMAL-c2x載體上，成功在E.coliBL21（DE3）高效表達。表達后重組酶MBP-FFFFFChSase ABC I的酶活和比酶活分別為716.5 IU/L發酵液和1.15 IU/mg蛋白，重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為741.0 IU/L發酵液和1.13 IU/mg蛋白。SDS-PAGE表明MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的分子質量均為130 KDa，并且基本都為可溶性蛋白。