高富硒酵母菌株的篩選及其富硒特性分析

孫朝陽，張玉英，潘利華，楊思林，魏春廳，羅建平*

（1.合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽省華信生物藥業股份有限公司，安徽 界首 236502）

硒是人體所必需的微量元素，機體長期缺硒會導致克山病、糖尿病、大骨節病、心腦血管病、神經退行性疾病等多種疾病的發生[1]。自然界中硒以無機硒和有機硒的形式存在，與無機硒相比，有機硒的生物利用率高，易于動物吸收利用，且毒性低，適量補充有機硒對人體健康極為重要[2-3]。硒酵母是目前應用最為廣泛的一種食品級有機硒補充劑[4]，由酵母在生長過程中將外源無機態的硒轉化為菌體有機態的硒而獲得，其核心品質是富含高水平的有機硒[5-6]。因此，篩選出高水平將無機硒轉化為有機硒的富硒酵母菌株對富硒酵母的生產至關重要。

目前，富硒酵母菌株的篩選國內外都是采用含高濃度無機硒的培養基直接對自然來源的菌株或物理化學誘變的菌株進行馴化分離以獲得目的菌株[7-9]，所分離出的菌株常常表現出在高濃度無機硒下生長良好，但有機硒積累水平不高的現象[10]，從而增加反復篩選的工作強度[11-12]，且極少探討菌株富硒能力與有機硒合成相關酶表達的關系。在富硒酵母中，硒蛋白是有機硒的一種主要存在形式，其含量高低不僅是富硒酵母品質的一個重要指標，同時也反映出富硒酵母將無機硒轉化為有機硒的能力[13]。大量研究揭示，在硒蛋白的生物合成中，硒磷酸合成酶（selenophosphate synthetase，SPS）為限速酶，它在腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的參與下催化無機硒生成硒代磷酸，由于硒代磷酸是硒蛋白合成的活性硒供體，所以SPS催化硒代磷酸生成的活性高低決定了硒蛋白的合成水平[14-16]。有研究表明，SPS對H2O2敏感，一定濃度的H2O2可顯著抑制SPS活性，進而抑制硒代磷酸的生成和硒蛋白的合成，降低細胞富集有機硒的能力[15-16]。因此，本研究將以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為出發菌株、以H2O2為選擇壓力進行高富硒酵母菌株的誘變篩選和富硒特性分析，以期為富硒酵母的選育提供新的思路，為富硒酵母的生產提供優良的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國工業微生物菌種保藏管理中心（館藏號：1412）。

1.1.2 化學試劑

Na2SeO3、NaN3、Na2MoO4、NaOH、甲酸、濃氨水、甲苯、濃硫酸、高氯酸：上海國藥集團化學試劑有限公司；H2O2：廣東恒健制藥有限公司；鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na：上海陽光生物科技有限公司；3,3'-二氨基聯苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）：華中海威（北京）基因科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；酵母蛋白提取試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司；微生物硒磷酸合成酶SeP酶聯免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司。實驗所用試劑均為分析純和生化試劑。

1.1.3 化學試劑

液體培養基：麥芽膏粉130 g/L、氯霉素0.1 g/L，121 ℃滅菌20 min。

固體培養基：麥芽膏粉130 g/L、氯霉素0.1 g/L、瓊脂15 g/L，培養基使用時加入定量蒸餾水溶解、調節pH分別至pH 5.6±0.2和pH 6.0±0.2，經121 ℃滅菌20 min[17]。

1.2 儀器與設備

HQ45Z恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；SKP-02電熱恒溫培養箱：湖北省黃石市醫療器械廠；DGF30/7-I電熱鼓風干燥箱：南京實驗儀器廠；V1100可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機：上海天美科學儀器有限公司；MDF-U73V超低溫冰箱、MLS-3750高壓滅菌鍋：日本SANYO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與搖瓶培養

菌種固體斜面活化24 h后，挑取一環于裝液量為50 mL/250 mL麥芽汁液體培養基搖瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養24 h作為活化的菌種。取活化的菌種以10%的接種量接種到裝液量為50 mL/250 mL搖瓶中振蕩培養，培養溫度為28 ℃，振蕩轉速為180 r/min[18]。

1.3.2 菌株生長曲線的測定

采取分光光度法測定菌種的生長曲線。活化的菌種在搖瓶培養過程中每隔4 h于波長560 nm條件下測定培養液的OD560nm值，繪制菌株的生長曲線[19]。

1.3.3 NaN3和H2O2處理條件的確定

活化的出發菌株經搖瓶培養至6 h時，取培養液加入終濃度為10 moL/L的NaN3，分別誘變處理0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，8 000 r/min離心10 min，棄上清并經無菌蒸餾水離心洗滌兩次，取誘變的菌體轉入50 mL無菌水的搖瓶中振蕩20 min（28 ℃、180 r/min），用涂片計數法在顯微鏡下計數并調整菌懸液至相同的濃度。取上述菌懸液1 mL按照10倍稀釋法逐級稀釋至10-3，取該菌懸液0.1 mL移入平板培養基上，無菌玻璃棒涂布，在28 ℃下靜置培養48 h后進行菌落計數，計算誘變處理后的每mL菌液內的活菌數，確定NaN3的誘變條件。

取經搖瓶培養6 h的出發菌株，分別加入1 mL含量為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的H2O2后繼續培養至24 h，同前法測定菌體的生長，確定H2O2的篩選條件。

1.3.4 菌株的誘變與篩選

活化的出發菌株經搖瓶培養至6 h時，加入終濃度為10 mol/L的NaN3誘變處理40 min，經無菌蒸餾水離心洗滌2次后，轉入新的液體培養基中搖瓶培養（28 ℃、180 r/min）6 h，加入1 mL含量為2.50%的H2O2，繼續培養至24 h，再經無菌蒸餾水離心洗滌2次，用50 mL無菌蒸餾水振蕩20 min，制備菌懸液；取菌懸液1 mL按照10倍稀釋法逐級稀釋至10-3，取稀釋的菌懸液0.1 mL移入平板培養基上，無菌玻璃棒涂布后，在28 ℃條件下靜置培養48 h，獲得存活菌株的單菌落。挑取單菌落用2.50%～3.00%的H2O2進行復篩，并在加入1 mL H2O2（2.50%）的搖瓶中連續傳代培養6次，進行菌株的H2O2耐受穩定性測定。

1.3.5 菌株的富硒培養

將活化的出發菌種、誘變菌種搖瓶培養，分別在6 h時加入終質量濃度為25 μg/mL的Na2SeO3溶液，繼續培養至48 h，取酵母培養液于8 000 r/min下離心10 min收集菌體，用去離子水離心洗滌2～3次后，菌體于60 ℃烘干至恒質量，留待測定硒的含量[20]。

1.3.6 硒的測定

樣品中總硒和無機硒的測定按文獻方法進行，有機硒為總硒中減去無機硒的含量[21]。蛋白硒含量測定時，按照文獻的方法[13]，取干燥的樣品加入定量的去離子水，用NaOH溶液調節pH至11，冰浴超聲2 h、37 ℃條件下振蕩保溫2 h后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清加硫酸銨至飽和，經4 ℃過夜、離心取沉淀、透析、冷凍干燥得蛋白樣品，同前法測定樣品中總硒的含量，計算每克蛋白的硒含量。

1.3.7 硒磷酸合成酶活性的測定

將活化的出發菌種、誘變菌種搖瓶培養，分別在6 h時加入終質量濃度為25 μg/mL的Na2SeO3溶液后繼續培養。培養過程中，定時取酵母培養液，采用酵母蛋白提取試劑盒提取酵母蛋白、BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質含量、微生物硒磷酸合成酶SeP試劑盒測定硒磷酸合成酶活性。

1.3.8 數據統計與分析

實驗數據均以平均值±標準差表示，采用Origin 8.6軟件繪制圖表，利用SPSS17.0軟件進行數據統計處理，應用One-way方差分析（anaylsis of variance，ANOVA）比較不同試驗組間的差異。

2 結果與分析

2.1 誘變與篩選條件的確定

2.1.1 菌株生長曲線

圖1 出發菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of the starting strain

由圖1可知，將活化的出發菌株接入未加硒的液體培養基中振動培養，在0～4 h期間菌株生長緩慢，為滯緩期；4～16 h菌株生長加快，菌體濃度快速增加，為對數生長期；16～48 h菌體濃度基本保持不變，為穩定期。因此，選擇生長6 h的出發菌株進行誘變和篩選。

2.1.2 NaN3誘變處理

NaN3是一種引發基因點突變的化學誘變劑，誘變譜帶寬、誘變效率高[22]，本研究采用NaN3對酵母菌株進行誘變，結果見圖2。由圖2可知，當固定NaN3終濃度為10 μmol/L時，隨著NaN3誘變時間的增加，菌株的存活率相應逐漸下降，當誘變時間為40 min時，菌株的致死率接近80%，再增加誘變時間菌體的存活率很低將不利于篩選。因此，采用終濃度為10 μmol/L的NaN3溶液處理菌株40 min為誘變條件。

圖2 NaN3誘變處理對菌株存活的影響Fig.2 Effect of NaN3 mutagenize on the strain survival

2.1.3 H2O2處理誘變處理

圖3 H2O2處理對菌株生長的影響Fig.3 Effect of H2O2 treatment on the strain growth

由圖3可知，出發菌株對低濃度的H2O2具有一定的耐受，當加入H2O2濃度在0.50%～0.75%時，菌株的生長急劇下降，H2O2濃度達到0.75%，菌株的生長僅有未處理菌株的10.8%，當H2O2濃度＞2.00%時，菌株全部死亡，因此確定2.50%的H2O2濃度為菌株生長的致死濃度。因此，選擇2.50%的H2O2作為選擇壓力對誘變后的菌株進行篩選。

2.2 富硒酵母菌株的篩選與鑒定

2.2.1 富硒酵母菌株的初篩

搖瓶培養6 h的出發菌株用10 μmol/L NaN3溶液誘變處理40 min后，經搖瓶恢復培養、2.50%的H2O2篩選和平板涂布培養，結果見圖4。由圖4可知，可得到兩個單菌落，而未經誘變的出發菌株經H2O2篩選、平板涂布培養未見生長的菌落。

圖4 平板培養基上的菌株初篩結果Fig.4 Primary screening results of strain growth on plate medium

2.2.2 富硒酵母菌株的復篩及抗性穩定性

將初篩獲得的兩個菌株分別命名為HXS-01和HXS-02，進行H2O2復篩，結果見圖5。由圖5A可知，兩個菌落在H2O2加入濃度為2.50%～3.00%的搖瓶中生長良好，與無H2O2存在的搖瓶培養相比，它們的生長僅有10%～20%的下降，表明這兩個菌落對致死濃度（2.50%）的H2O2具有抗性，且對更高濃度（3.00%）的H2O2具有較好的耐受。由圖5B可知，在含H2O2的搖瓶中進行連續6次的傳代培養，結果表明其對致死濃度（2.50%）的H2O2具有穩定的抗性。

圖5 篩選菌株對不同H2O2濃度的耐受性（A）及傳代穩定性（B）Fig.5 Tolerance of screened strains to different H2O2 concentrations(A) and genetics stability (B)

2.2.3 富硒酵母菌株的富硒特性

為了鑒定篩選出的菌株是否具有高富硒能力，將出發菌株和HXS-01、HXS-02菌株分別進行搖瓶富硒培養，48 h后收集菌體，測定菌體的生物量、總硒及有機硒含量與產率，結果見表1。

由表1可知，與出發菌株相比，菌株HXS-01和HXS-02在含Na2SeO3的培養基中生長相對較慢，培養48 h后兩者的生物量分別是出發菌株的88.8%和89.6%，但它們的總硒含量及總硒產率均顯著高于出發菌株（P＜0.05），菌株HXS-01和HXS-02的總硒含量分別是出發菌株的4.4倍和4.7倍、總硒產率分別是出發菌株的3.9倍和4.2倍，并且菌株HXS-01和HXS-02的有機硒轉化能力較高，兩者的有機硒含量分別是出發菌株的4.7倍和5.0倍、有機硒產率分別是出發菌株的4.1倍和4.5倍，有機硒占總硒的百分比均超過97.5%，而出發菌株有機硒占總硒的百分比僅為92.6%。結果顯示，以NaN3為誘變劑、H2O2為選擇壓力可以有效篩選出高富硒能力的酵母菌株，所篩選出的菌株HXS-01和HXS-02無論是總硒、有機硒含量方面，還是總硒、有機硒產率方面都優于出發菌株，且菌株HXS-02富硒及有機硒轉化能力優于菌株HXS-01。

表1 出發菌株與菌株HXS-01及HXS-02的富硒能力比較Table 1 Comparison on selenium enrichment potential between the original strain,strain HXS-01 and HXS-02

2.2.4 富硒酵母菌株的富硒穩定性分析

圖6 出發菌株與菌株HXS-01及HXS-02的富硒能力穩定性比較Fig.6 Comparison of the stability of selenium-enriched ability of the original,strains HXS-01 and HXS-02

將菌株HXS-01和HXS-02在含Na2SeO3的培養基中進行連續6代搖瓶培養，結果見圖6。由圖6可知，兩個菌株的干質量（見圖6A）、菌體的總硒含量（見圖6B）和總硒產率（見圖6C）均保持較好的穩定性，有機硒占總硒的百分比穩定在97%以上（見圖6D），而出發菌株雖然生長高于菌株HXS-01和HXS-02，但其總硒含量和總硒產率遠低于菌株HXS-01和HXS-02，且有機硒占總硒的百分比一直維持在92%左右。6次連續傳代培養后，菌株HXS-01和HXS-02的平均總硒含量、有機硒含量、總硒產率、有機硒產率分別是2 138.68 μg/g和2 290.74 μg/g、2 195.11 μg/g和2 236.49 μg/g、7155.22μg/L和7606.98μg/L以及7009.47μg/L和7426.77μg/L，為出發菌株的3.9～5.2倍。結果表明，菌株HXS-01和HXS-02具有穩定的高富硒和高有機硒轉化的能力。

2.3 富硒酵母菌株的SPS活性和蛋白硒含量分析

圖7 菌株HXS-01和HXS-02硒磷酸合成酶活性（A）及蛋白硒的含量（B）Fig.7 Activities of selenophosphate synthetase (A) and contents of selenium in proteins(B)of strains HXS-01 and HXS-02 strains

由圖7A可知，在搖瓶富硒培養階段，出發菌株和菌株HXS-01、HXS-02的SPS活性呈現相似的緩慢增加趨勢，菌株HXS-01和HXS-02的SPS活性均顯著高于出發菌株，且菌株HXS-02的SPS活性總體上高于菌株HXS-01。由圖7B可知，菌株HXS-01、HXS-02的搖瓶富硒培養后的菌體蛋白硒含量分別是出發菌株的1.9倍和2.1倍。結果表明，經H2O2篩選出的誘變菌株具有高SPS活性，由于SPS為硒蛋白生物合成的限速酶，因此可以推測高SPS活性賦予了誘變菌株具有高水平的蛋白硒合成能力[10，15-16]。

3 結論

本研究以釀酒酵母為出發菌株，以NaN3（10 μmol/L、處理40 min）為誘變劑、H2O2（2.50%）為選擇壓力，成功篩選出2株可高水平將無機硒轉化為有機硒的富硒酵母菌株HXS-01和HXS-02。富硒特性分析表明，菌株HXS-01和HXS-02的總硒和有機硒含量分別比出發菌株高3.4～3.7倍和3.7～4.0倍，均在2 100 μg/g以上，48 h搖瓶富硒培養的總硒和有機硒產率分別比出發菌株高2.9～3.2倍和3.1～3.5倍，均在7 000 μg/L以上，有機硒占總硒的百分比均超過97%，經連續6次傳代后它們仍保持穩定的富硒和轉化有機硒的能力，且它們的硒磷酸合成酶活性和蛋白硒含量均顯著高于出發菌株，菌株HXS-02的富硒能力優于菌株HXS-01。結果表明，耐H2O2的誘變菌株不僅具有高的富硒及轉化無機硒為有機硒的能力，而且具有高的SPS活性，提示它們的高富硒能力與高SPS活性相關，鑒于SPS是硒蛋白合成的關鍵酶且H2O2可抑制其活性，可以說明耐H2O2的菌株具有高的SPS活性，而高SPS活性的菌株具有高水平富集、轉化無機硒為有機硒的能力。利用H2O2作為一種新的選擇壓力可以有效篩選出具有高SPS活性的富硒酵母菌株，并可用于生產實際。