基于高通量測序技術(shù)巴彥淖爾市酸粥中細菌多樣性分析

張 青，郭淑文，蘇 靖，雍雅萍，袁曉黎，郭 瑞*

（河套學(xué)院 農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

酸粥作為我國內(nèi)蒙地區(qū)一種傳統(tǒng)的發(fā)酵淀粉制品，已有數(shù)千年歷史，因其特殊的發(fā)酵工藝和營養(yǎng)價值，以及特有的酸滑口感而深得消費者的喜愛[1]。近年來，越來越多的研究者針對酸粥微生物多樣性進行了研究。王玉榮等[2]對內(nèi)蒙古地區(qū)3份酸粥樣本中的細菌多樣性進行解析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌（Lactobacillus）和醋酸桿菌（Ace tobacter），通過傳統(tǒng)微生物學(xué)手段共分離到9株乳酸菌，分別為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacilus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）；薛建崗等[3]對內(nèi)蒙古西部地區(qū)自然發(fā)酵酸粥中微生物組成進行分析發(fā)現(xiàn)，其含有較高的乳酸菌屬。前人的研究為解析微生物的多樣性提供一定的參考依據(jù)，而這些研究大多采用傳統(tǒng)的生物學(xué)手段，并不能準確揭示酸粥中的物種構(gòu)成和多樣性，因此，采用分子生物學(xué)技術(shù)手段對酸粥中的細菌多樣性進行研究顯得尤為必要。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，以Illumina MiSeq為代表的第二代測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性解析中[4]，其不僅準確性高，還可以多樣品平行測序，提升測序速度。賈麗艷等[5]采用Illumina MiSeq測序技術(shù)解析了傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中細菌群落的結(jié)構(gòu)和動態(tài)演替，為改善白酒風(fēng)味提供了依據(jù)；王玉榮等[6]采用此技術(shù)解析了當(dāng)陽鲊廣椒中的細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能改善鲊廣椒的風(fēng)味品質(zhì)。Illumina MiSeq測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用也為解析酸粥中的細菌多樣性提供了有效的技術(shù)手段。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對采集自內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)的10份酸粥樣品中的細菌多樣性進行解析，同時結(jié)合多元統(tǒng)計學(xué)和基因預(yù)測等手段對酸粥中細菌菌群結(jié)構(gòu)和細菌功能及表型進行比較研究，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的乳酸菌資源提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸粥：采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市的農(nóng)戶家中，分別從10戶農(nóng)戶家中共采集10個樣本，分別編號為BM1～BM10。

1.1.2 試劑

食品基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM FastPfu Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R930機架式服務(wù)器：美國Dell公司；IlluminaMiSeqPE250高通量測序平臺：美國Illumina公司；CR21N高速離心機：日本日立公司；vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸粥樣品微生物宏基因組DNA提取

稱取3.0 g酸粥樣品，使用食品基因組DNA提取試劑盒對酸粥樣品中的微生物宏基因組DNA進行提取。

1.3.2 細菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴增及測序

以提取的宏基因組為模板，使用包含不同核苷酸標簽（barcode）的引物338F/806R，對提取出的宏基因組DNA的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增[2]。

使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對PCR擴增產(chǎn)物的質(zhì)量進行檢驗，并將檢驗合格的擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參照郭壯等[7]對窖泥微生物多樣性研究中序列質(zhì)控的參數(shù)對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，并依照barcode信息進行歸類，將序列分發(fā)到不同的樣本中。

利用QIIME v1.70平臺對酸粥中的細菌結(jié)構(gòu)和多樣性進行解析[8]。具體的生物信息分析過程：（1）使用PyNAST軟件[9]對高質(zhì)量序列進行校準和比對；（2）通過100%相似度建立非冗余的序列集后，按97%的相似度構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）；（3）使用ChimeraSlayer軟件[10]對OTU中的嵌合體序列進行識別和刪除；（4）基于Greengenes v13.8[11]、RDP v11.5[12]和SILVA v128[13]數(shù)據(jù)庫對每個OTU的代表性序列進行注釋；（5）使用FastTree軟件構(gòu)建基于代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；（6）計算α多樣性指數(shù)（超1（Chao1）指數(shù)和辛普森指數(shù)）和β多樣性，以評估每個酸粥樣品中微生物物種的豐度和多樣性。

基于Greengenes數(shù)據(jù)庫對序列進行劃分和注釋，使用PICRUSt軟件[14]和BugBase在線網(wǎng)站（https：//bugbase.cs.umn.edu/）[15]對酸粥中微生物的基因功能和表型進行預(yù)測，同時參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫進行基因功能預(yù)測。

1.3.4 多元統(tǒng)計學(xué)分析

基于加權(quán)和非加權(quán)的主成分分析（principal component analysis，PCA）對酸粥的菌群結(jié)構(gòu)進行分析；使用圍繞中心點的劃分（partitioning around medoid，PAM）對酸粥的屬水平結(jié)構(gòu)進行分析；使用Wilcoxon test對不同分組酸粥中細菌的基因功能和表型進行顯著性分析；使用R軟件進行矩陣數(shù)據(jù)的分析和繪圖；使用Origin 2019b軟件進行數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸粥中細菌菌群豐富度和多樣性分析

采用高通量測序技術(shù)對酸粥樣品中細菌菌群的豐富度和多樣性進行分析，結(jié)果見表1。

表1 酸粥樣品細菌菌群豐富度及多樣性分析Table 1 Analysis of richness and diversity of bacterial community in sour porridge samples

由表1可知，所有樣本共產(chǎn)生225 547條高質(zhì)量序列，平均每個樣本22 555條。按97%的相似度進行OTU的劃分后共得到6 681個，刪除21個嵌合體OTU后平均每個樣本666個OTU。由表1亦可知，10份酸粥樣品間的OTU數(shù)和α多樣性指數(shù)存在較大差異，其中樣品BM10的OTU數(shù)和超1指數(shù)最大，而樣品BM8的辛普森指數(shù)最大，辛普森指數(shù)和超1指數(shù)常用來評價環(huán)境樣本中微生物的多樣性和豐度[16]。由此可見，樣品BM8中細菌的多樣性最高，樣品BM10中微生物的豐度最高，且同一地區(qū)酸粥樣本中的細菌微生物的多樣性和豐度之間存在著明顯的差異。

2.2 酸粥中細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

從10份酸粥樣本中共檢測出9個細菌門和55個細菌屬，其中優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢細菌屬相對含量的比較見圖1。

圖1 酸粥樣品中優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬相對含量的比較分析Fig.1 Comparison and analysis of the relative contents of dominant phylum and genus in sour porridge samples

由圖1可知，10份酸粥樣本中有2個優(yōu)勢菌門（平均相對含量＞1%），分別為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對含量分別為61.91%和37.33%；優(yōu)勢菌屬（平均相對含量＞1%）亦有2個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter），平均相對含量分別為61.37%和37.22%，兩者累計平均相對含量為98.59%。由此說明，酸粥中的細菌幾乎均為產(chǎn)酸菌。王玉榮等[6]對內(nèi)蒙古烏拉特前旗、杭錦后旗和準格爾旗地區(qū)酸粥的細菌多樣性進行研究發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬與本研究一致，但其平均相對含量與本研究的結(jié)果存在一定的差異。酸粥中主要以乳酸桿菌和醋酸桿菌為主，但其不同農(nóng)戶家制作的酸粥中細菌菌群之間也存在著一定的差異。由此說明，兩者在酸粥的發(fā)酵過程中有著至關(guān)重要的作用，而不同的制作方法和制作環(huán)境也可能直接或間接影響著酸粥中的菌群構(gòu)成[17-18]。

乳酸菌作為現(xiàn)代食品加工產(chǎn)業(yè)中常用的發(fā)酵菌株之一，在發(fā)酵蔬菜制品和發(fā)酵乳制品等方面應(yīng)用廣泛，其具有應(yīng)用范圍廣和經(jīng)濟價值高等特點。研究人員圍繞乳酸菌開展了許多卓有成效的研究，HUANG L等[19]研究發(fā)現(xiàn)一株分離于中國傳統(tǒng)食品豆腐中的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）C88能抑制黃曲霉毒素B1，而KHAN I等[20]研究表明，植物乳桿菌DGK-17能夠明顯改善韓國泡菜的營養(yǎng)品質(zhì)，說明乳桿菌屬具有改善發(fā)酵制品品質(zhì)的潛力。醋桿菌屬亦廣泛存在發(fā)酵食品中[21]，其產(chǎn)生的乙酸和葡萄糖酸等產(chǎn)物能顯著改善產(chǎn)品的品質(zhì)。目前，產(chǎn)業(yè)化中應(yīng)用的乳酸菌菌株大多來自于發(fā)酵乳制品和發(fā)酵蔬菜制品，通過對酸粥中的乳酸菌進行相關(guān)研究，進一步對乳酸菌進行收集，以期對后續(xù)乳酸菌遺傳多樣性研究和產(chǎn)業(yè)化推動具有積極的意義。

進一步對酸粥樣本中OTU出現(xiàn)的頻率和平均相對含量進行分析，以便于對酸粥樣品中的核心細菌類群進行研究，結(jié)果見圖2。

圖2 酸粥樣本中OTU的出現(xiàn)次數(shù)和共有OTUFig.2 Occurrence times and common OTU in sour porridge samples

由圖2可知，獨有OTU數(shù)（僅在一個樣品中出現(xiàn)）占總數(shù)的88.26%，擁有序列數(shù)3 900條，占全部序列數(shù)的1.81%。而在所有樣品中出現(xiàn)的OTU數(shù)為0。由圖2亦可知，酸粥樣品中共有OTU（在80%的樣品中出現(xiàn)）數(shù)有6個，其所包含的序列數(shù)占全部序列數(shù)的10.08%，其中醋桿菌屬、農(nóng)桿菌屬（Agrostis）和乳桿菌屬的平均相對含量分別為9.01%、0.55%和0.45%。由此說明，雖然酸粥樣本中存在大量的核心菌群，但每份樣本中均存在許多獨特的細菌類型。酸粥中乳桿菌屬平均相對含量＞60%，但其共有OTU的比例＜0.50%，說明酸粥中隸屬于乳桿菌屬的細菌在種或株水平上存較大的差異。

2.3 酸粥中細菌菌群結(jié)構(gòu)的比較

為進一步研究酸粥中細菌菌群結(jié)構(gòu)在整體上的差異，基于非加權(quán)和加權(quán)的UniFrac距離對酸粥中的菌群結(jié)構(gòu)進行主成分分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，酸粥在兩份坐標軸的空間排布并不相同，圖3a坐標軸中的樣本在空間排布上較為分散，而圖3b坐標軸中的樣本在空間排布上呈現(xiàn)明顯的聚類趨勢。由此說明，酸粥中存在著許多低豐度物種，且不同樣本中低豐度物種之間存在著較大差異，而不同酸粥樣本中優(yōu)勢菌的差異卻相對較小。

圖3 基于非加權(quán)（a）和加權(quán)（b）的UniFrac距離酸粥樣品中細菌菌群結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterial community structure in sour porridge samples based on unweighted (a) and weighted(b) UniFrac distance

為進一步探究不同酸粥樣本在屬水平上的差異，本研究基于屬水平對10份酸粥樣品進行PAM分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于細菌屬水平酸粥樣品的圍繞中心點的劃分分析Fig.4 Partitioning around medoid analysis of sour porridge samples based on bacterial genera level

由圖4可知，10份酸粥樣品被分為2個聚類，其中樣品BM3、BM4、BM5、BM8和BM10隸屬于聚類I，而樣品BM1、BM2、BM6、BM7和BM9隸屬于聚類II。對比不同聚類中細菌屬的相對含量發(fā)現(xiàn)，聚類I以醋酸菌為主（Acetobacter與Lactobacillus的平均比值為1.31），而聚類II以乳桿菌為主（Lactobacillus與Acetobacter的平均比值為4.39）。由此說明，不同聚類中醋桿菌屬和乳桿菌屬的相對含量差異較大，對酸粥中菌群的整體結(jié)構(gòu)具有較大的影響。

2.4 酸粥中細菌的功能預(yù)測和表型預(yù)測

以PAM分析的結(jié)果為分組依據(jù)，進一步對酸粥中細菌的基因功能和表型進行預(yù)測和差異化分析。酸粥中細菌一級功能層的比較分析見圖5。

圖5 酸粥樣品中細菌一級功能層相對豐度的箱型圖Fig.5 Box diagram of the relative abundance of first-level functional layer of bacteria in sour porridge samples

由圖5可知，所有的一級功能層中，聚類I與聚類II的8個一級功能層具有顯著性差異（P＜0.05），且均在聚類I中顯著富集。聚類I的樣品中有更多的序列與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運代謝和能量的生產(chǎn)轉(zhuǎn)換相關(guān)。由此說明，聚類I樣品中細菌菌群對于碳水化合物的利用更加頻繁，細菌的生長繁殖更加快速，這可能有利于酸粥的發(fā)酵。酸粥中細菌的表型預(yù)測結(jié)果見圖6。

圖6 酸粥樣品中細菌表型的比較分析Fig.6 Comparison and analysis of bacterial phenotypes in sour porridge samples

由圖6可知，在9種細菌表型中，聚類I與聚類II有6種表型存在顯著性差異（P＜0.05），分別為需氧、可移動原件、生物膜的形成、革蘭氏陰性、革蘭氏陽性和氧化脅迫耐受，其中需氧、生物膜的形成、革蘭氏陰性和氧化脅迫耐受在聚類I中的強度顯著較高（P＜0.05），而其他顯著表型呈現(xiàn)相反趨勢。由此說明，與聚類II相比，聚類I酸粥樣品中革蘭氏陰性菌的繁殖更加強烈，即醋桿菌屬（革蘭氏陰性菌、專性好氧菌）在聚類I中具有更強的繁殖能力。

3 結(jié)論

內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾盟酸粥樣品中的細菌隸屬于9個細菌門的55個屬，樣品間細菌的多樣性和豐度存在明顯差異，但優(yōu)勢細菌門均為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），兩者累計占比為99%；優(yōu)勢細菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter），兩者累計占比為98.59%。所有酸粥樣品可分為兩個聚類，聚類I以醋桿菌屬為主，聚類II以乳桿菌屬為主。基因預(yù)測結(jié)果表明，聚類I樣品中細菌菌群對于碳水化合物的利用更加頻繁，細菌的生長繁殖更加快速，而表型預(yù)測結(jié)果亦表明聚類I中樣品中革蘭氏陰性菌的繁殖更加強烈，即醋桿菌屬在聚類I中具有更強的繁殖能力。