醬香型白酒堆積過程腰線酒醅淺析

汪地強，陳良強，涂昌華*，秦 興，袁 頡，錢書楊

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

白酒釀造工藝在中國已經有一千多年的歷史，其獨樹一幟的特點便是利用自然發酵[1]。醬香型白酒釀造過程中的高溫堆積工藝作為大曲酒生產工藝中較為獨特的一環能夠通過網羅環境中的微生物進行發酵[2-4]，同時代謝產生如醇類[5]、有機酸類、酯類、醛類和吡嗪類[6]等多種酒體香味物質及前體物質，并為入窖發酵創造條件[7]。堆積前期，空氣流通，營養物質豐富，酒醅中各種微生物生長代謝旺盛，特別是酵母菌和霉菌[8-9]，堆積后期，酒醅溫度較高，不同部位氧氣濃度存在差異，微生物經自然馴化，為入窖發酵提供微生物基礎[10-11]。韓興林等[12]在對醬香白酒堆積發酵過程中代謝風味生成規律的分析中提出，堆積過程富集的微生物能夠產生大量酒體風味物質，與各輪次醬香基酒的品質具有一定的關聯性。周恒剛等[13-14]對比研究了堆積發酵和不堆積發酵對醬香型白酒酒質的影響，發現酒醅不堆積直接入窖會導致不產酒或產酒質量差等情況，表明堆積發酵是醬香型白酒生產中不可忽視的一個環節。

在醬香型白酒冬季生產過程中，堆積酒醅內部或表層處會出現酒醅表面呈白色或微黃色，在濕度大、發酵溫度高的環境條件下易成團狀，或帶“霉味”，且酒醅干燥，下窖時酒精味較濃。這種現象在醬香型白酒生產上被稱為“腰線”[15]。

江鵬等[15]提出腰線的形成主要原因是由于排與排之間酒醅溫差過大、過度糊化以及水分作用造成的發酵現象，但是對于不同種類的腰線并未進行深入研究。因此，本研究分析了不同腰線酒醅中的風味物質、真菌組成與代謝特征，以及二者的關系，有助于認識腰線酒醅在醬香型白酒生產過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰線酒醅樣品：取自某醬香型白酒生產車間，為一輪次堆積酒醅，具體信息如表1。

表1 不同類型腰線酒醅樣品信息Table 1 Information of different types of fermented grains

氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone，YPD）培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；固態模擬發酵培養基：將高粱粉碎，利用超純水調節水分至60%，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

MPSⅡ自動頂空固相微萃取裝置（solid-phase microextraction，SPME）：德國Gerstel公司；安捷倫7890A氣相色譜-5975C質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ME4002E電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；ALP高溫滅菌鍋：昆明倍捷科技有限公司；AFZ-2002-U型超純水系統：美國艾科浦國際有限公司；ESCO超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；SPX-250B-2型恒溫培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；LRH-250型生化培養箱：上海飛越實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅微生物分離純化與計數方法

采用稀釋涂布法對不同腰線酒醅樣品的酵母與霉菌進行分離，培養基稀釋度分別為10-4、10-5、10-6，于30 ℃恒溫培養箱靜置培養。3 d后按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》中平板計數法對酵母菌計數，并對不同形態菌株進行分離與純化。7 d后，按同樣方法對霉菌菌落計數與分離。

1.3.2 單菌株固態模擬發酵

將腰線樣品中分離得到的不同形態特征的菌株利用固態發酵培養基，于30 ℃恒溫培養箱，靜置培養7 d進行固態模擬發酵，發酵結束后，進行代謝產物分析。

1.3.3 固態樣品風味物質檢測方法

于20 mL頂空樣品瓶中加入3 g酒醅樣品，通過頂空固相微萃取技術（head-spacesolidphasemicroextraction，HS-SPME）進行萃取，再利用氣相色譜質譜聯用（GC-MS）儀進樣分析。氣相色譜分離條件：柱溫初始溫度為60 ℃，以6 ℃/min的升溫速率升至230 ℃，保持15 min；柱流量1.6 mL/min，采用恒壓模式；進樣口溫度230 ℃。質譜條件：電子能量為70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；采用全掃描方式（scan），使用35～550 amu的質量范圍，溶劑延遲5 min。將未知物質圖譜與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）08a.L Database中標準圖譜進行比對，進行定性分析。采用面積歸一化法確定相對含量。

1.3.4 數量處理分析

將得到的揮發性風味物質峰面積進行歸一化處理后，利用R語言3.6.1版本，pheatmap和VennDiagram包對腰線酒醅樣品的風味物質進行熱圖（heatmap）和韋恩圖（venn）分析；利用igraph包對菌株代謝產物進行關系網絡圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同腰線酒醅風味組成分析

對不同腰線酒醅風味檢測發現，共獲得45種風味物質，其中醇類10種，酸類8種，酯類6種。利用R語言對四種酒醅風味物質檢測數據進行分析，結果如圖1所示。

由圖1可知，得出不同類型腰線酒醅風味總量依次為D3＞D2＞D4＞D1；堆積5 d內部白色樣品D3的風味物質種類最多，達40種，其次是堆積11 d的外部白色樣品D2與堆積8 d的內部白色樣品D4，均為32種，外部黃色樣品D1的種類最少，為21種。其中（2R，3R）-丁二醇、β-乙基苯乙醇、苯甲醇、苯乙醇、異戊醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、愈創木酚、乙偶姻等17種風味物質是四個樣品共有的。這可能是由腰線酒醅的位置、溫度、堆積時間、微生物種類等特點共同影響的[16]。

D3樣品堆積5 d，此時微生物代謝旺盛，且處于酒醅內部，堆積溫度為37 ℃，不利于風味物質的揮發，所以風味物質含量最高；而D1堆積時間較長，微生物生長代謝較穩定，且位于表層，堆積溫度達45 ℃，疏松度較高，易于風味物質的揮發和前體物質的轉化，因此風味物質含量較低。

對比不同種類風味物質含量，乙酸含量最高，其次為苯乙醇，再次為乳酸乙酯。酒醅中的乙酸主要由醋酸菌在堆積過程產生，苯乙醇主要由酵母菌代謝產生[17]，4種酒醅均檢出苯乙醇，推測4種酒醅均含有一定數量的酵母菌，其中D2的苯乙醇含量明顯高于D1，可能是D1還含有大量霉菌，影響了酵母菌的生長代謝[18]。

圖1 不同堆積發酵酒醅風味物質含量熱圖（a）及種類Venn圖（b）Fig.1 Heat map of flavor contents (a) and Venn diagram (b) of flavor substances categories in different accumulated fermented grains

2.2 不同腰線酒醅的真菌數量

通過兩種不同培養基的微生物計數結果可知，堆積發酵酒醅中酵母菌數在106～108CFU/g之間，霉菌數在104～107CFU/g之間，表明堆積發酵過程中的真菌數量豐富，無論是好氧微生物，還是兼性厭氧微生物都能在這一過程中大量生長，而這與堆積發酵酒醅兼具有氧環境和無氧環境相關，因此在不同位置酒醅樣品的微生物種類組成也會有較大的差異性，從而造成酒醅風味成分和含量的區別。對4個樣品中的霉菌和酵母菌分離純化，并根據計數結果分析酒醅樣品的真菌結構。

圖2 4個酒醅樣品的真菌結構Fig.2 Fungal structure of 4 fermented grains samples

由圖2可知，D1的霉菌數量最多，尤其是擬青霉，可以達到5.6×107CFU/g，使酒醅的顏色呈微黃色。而D2則有最多的酵母菌計數結果，尤其是庫氏畢赤酵母，可以達到2.29×108CFU/g，因此酒醅的顏色呈白色。D4無論是霉菌數量，還是酵母菌數量都低于D1和D2，而這可能與發酵時長和所處位置相關。雖然D1和D2所含的主要菌種分別為擬青霉和庫氏畢赤酵母，但是在D1中也檢出較為豐富的酵母菌，為1.76×108CFU/g；D2中也同樣含有少量的擬青霉，為2×106CFU/g。說明腰線酒醅堆積發酵是多種微生物共同生長代謝所產生的結果，其中影響較大的主要是擬青霉和非產酒酵母菌。

D3和D4分別是5 d和8 d位于內部腰線酒醅，都為白色。與D1和D2相比，D3和D4的菌群結構更為多樣，且發酵8 d的酒醅樣品的霉菌和酵母菌菌落數量也比發酵5 d的酒醅樣品更多，但相較于D1和D2中的部分微生物仍要小幾個數量級，說明在堆積發酵階段前期主要是各種微生物的積累階段，此時由于環境適宜，尚不存在某種或某幾種突出的優勢菌種能夠對其他菌種造成抑制，如D1的擬青霉和D2的庫氏畢赤酵母，因此酒醅的性狀是存在較小的白點。同時，由于霉菌屬于好氧菌，但在D3和D4中也能檢測出大量霉菌的存在，意味著酒醅內部也存在微氧環境，而這與茅臺酒生產工藝中對于酒醅的疏松度要求相關。

2.3 代謝產物分析

將分離出的3株霉菌和3株酵母菌進行單菌株固態模擬發酵，待發酵完全后對培養基中的風味物質做檢測分析，分離出來的微生物與培養基中風味物質的種類之間的關系如圖3所示。

由圖3可知，酒醅空白樣品為堆積發酵酒醅發酵代謝產生的風味物質，共有19種，其中醇類2種，酸類5種，酯類5種。霉菌YM5能夠特異性地代謝乳酸乙酯，因此含YM5較多的D3樣品中的乳酸乙酯含量最高。酵母菌能夠特異性地代謝11種風味物質，主要為酸類化合物、酯類化合物和醇類化合物，因此酵母豐度較高的D2、D3和D4中的風味物質種類明顯較擬青霉豐度是絕對優勢菌種的D1多，與MENG X等[19]的研究結果一致。由此可知，堆積過程中產生的風味物質占總的風味物質的大部分，但是腰線中的微生物代謝卻能夠充分補充酒醅中風味物質的種類和含量，尤其是各種酵母菌的代謝產物。WU Q等[20-22]提出白酒發酵中風味物質的多樣性來源于內源微生物和外源微生物之間的代謝競爭，而腰線層內部會受到原生微生物的影響，外部直接與空氣接觸，因此有多種霉菌和酵母菌等好氧或兼性厭氧微生物的大量生長繁殖，從而造就了腰線層酒醅的特殊性。

圖3 微生物與風味代謝物質關系網絡圖Fig.3 Network of the relationship between microorganisms and flavor metabolites

3 結論

通過對不同腰線酒醅風味物質進行對比，得出酒醅風味物質總量依次為：D3＞D2＞D4＞D1，可能是由于不同腰線酒醅的位置、溫度、堆積時間等因素的差異影響了微生物的代謝結果；堆積5 d內部白色樣品D3的風味物質種類最多，達40種，其次是堆積11 d的外側白色樣品D2與堆積8 d的內部白色樣品D4，均為32種，外部黃色腰線酒醅D1的種類最少，為20種，共有17種風味物質在4個樣品中均有檢出；不同種類風味物質中，乙酸含量最高，其次為苯乙醇，再次為乳酸乙酯。

對比不同酒醅微生物計數結果可知，堆積發酵酒醅中酵母菌在106～108CFU/g，霉菌在104～107CFU/g之間，表明堆積發酵過程中的真菌數量豐富，這與堆積發酵酒醅兼具有氧環境和微氧環境相關；其中D1樣品中擬青霉數量最多，導致樣品呈微黃色，D1、D2、D4樣品含有大量酵母菌，因此呈白色。進一步分離純化樣品中的霉菌和酵母菌，進行代謝產物分析，發現腰線酒醅中的微生物代謝過程能夠增加酒醅中風味物質的種類和含量。

上述腰線酒醅風味物質的差異主要是由于微生物菌群結構不同，從而使得微生物代謝產物不同。為了更好地分析四種酒醅菌群結構與風味物質的關系，還需對酒醅微生物進行分離、純化，進一步研究不同真菌利用高粱發酵生產代謝產物的差異。