揚州稀甜醬中乳酸菌的分離鑒定及抑菌活性初探

丁娟芳，楊 嘉 *，孫長花

（1.揚州市職業大學 生物與化工工程學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225000）

乳酸菌是一類可發酵糖類物質，以乳酸為主要代謝產物的細菌，通常被認為是安全的益生菌[1-2]。在系統分類學上，乳酸菌分別隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），包含51個屬，至少包括741個種[3]。近幾年，乳酸菌對一些腐敗菌和食源致病菌的抑制作用引起了極大的關注。已報道的抑菌活性乳酸菌有發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcal lactis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）等[4-7]，部分乳酸菌的抑菌機制也陸續得到闡明[8-10]。

揚州醬菜是江蘇揚州地區的傳統食品，歷史悠久，風味獨特，深受消費者喜愛。稀甜醬是生產揚州醬菜的主要原料之一，其釀制過程是醬菜生產中的一個重要環節[11]，乳酸菌的發酵作用是其風味形成的關鍵因素之一[12]。在稀甜醬的中溫發酵過程中，乳酸菌大量增殖，將部分糖分轉化成適量的有機酸，從而賦予了產品特有的風味。

傳統發酵食品中含有豐富的微生物資源，而揚州稀甜醬中乳酸菌的多樣性及活性的研究尚無報道。本研究旨在從揚州稀甜醬中分離、純化乳酸菌，采用形態觀察、生理生化試驗和分子生物學方法對其進行鑒定，闡述其多樣性，并對發酵濾液的抑菌活性進行研究，為進一步開發利用提供良好的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

稀甜醬：揚州三和四美醬菜有限公司。

1.1.2 培養基

MRS瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、腦心浸液肉湯培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

KOD FX脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（1.0 U/μL）：日本TOYOBO公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒：德國Qiagen公司；DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；瓷珠菌種保存管：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；過氧化氫酶（2 000～5 000 U/mg）：美國Sigma-Aldrich公司；碳酸鈣、氫氧化鈉、甘油、雙氧水（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 指示菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 6538）、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（ATCC 19115）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）（ATCC 6633）：廣東省食品微生物安全工程研究開發中心。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；SQ510C滅菌鍋：日本YAMATO公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；Bugbox M厭氧工作站：英國Ruskinn公司；AL104電子分析天平、FE22 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ECLIPSE生物顯微鏡：日本尼康公司；3-30k冷凍臺式高速離心機：德國Sigma公司；U-3010紫外分光光度計：日本Hitachi公司；9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國ABI公司；DYY-8C電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析儀：北京六一生物科技有限公司；FC-08拍打式均質器：杭州賽普科學儀器有限公司；Micro Stainer全自動革蘭氏染色儀：上海皓信生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取10 g稀甜醬樣品于無菌均質袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，拍擊均質1 min，制成10-1樣品均液。吸取1 mL10-1樣品均液于9 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻，得到10-2樣品均液。重復以上操作制成逐級稀釋后的樣品均液。吸取稀釋度為10-5的樣品均液1 mL于無菌平皿內，將冷卻至適宜溫度的含有0.2 g/L碳酸鈣的MRS固體培養基傾注平皿，混合均勻后置于36 ℃培養箱中培養48 h。挑取有溶鈣圈的單菌落，純化后進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，革蘭氏陽性且接觸酶陰性[13-14]的菌株列為疑似乳酸菌，由瓷珠吸附后置于含50%甘油的MRS肉湯培養基中，-70 ℃超低溫環境中進行保存。

1.3.2 菌種鑒定

（1）形態觀察和生理生化鑒定

將疑似乳酸菌活化2代后接種于MRS瓊脂培養基，36 ℃培養24 h后觀察其菌落形態。參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[13]和《常見細菌系統鑒定手冊》[14]對乳酸菌進行生理生化鑒定，碳源利用試驗采用生化鑒定管進行。

（2）分子生物學鑒定

按照文獻[15]方法提取菌株的基因組，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對分離菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增[15]，PCR擴增產物純化后進行測序。引物合成及測序結果均委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

將測序結果與美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行BLAST比對搜索，選擇序列同源性較高的菌株的16S rRNA序列，用Clustal X進行多重比對，采用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，分析分離菌株與已知菌株的同源性。

1.3.3 發酵濾液抑菌試驗

按照文獻[15]的方法準備乳酸菌菌液，使菌液OD600nm值在0.6～0.8范圍內。將菌液以10%（V/V）的接種量添加到50 mL MRS肉湯培養基中，36 ℃靜置培養24 h。培養液經10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm無菌濾膜過濾后于4 ℃條件下保存。

濾液的抑菌活性試驗采用牛津杯平板擴散法[16]進行，指示菌分別為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、單核細胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）、大腸埃希氏菌（E.coli）和枯草芽胞桿菌（B.subtilis），每項試驗設置3組平行和1組空白對照（MRS肉湯培養基）。用2代指示菌的新鮮腦心浸液肉湯培養液傾注營養瓊脂平板制備試驗平板，試驗平板中菌體濃度控制在1×105～1×106CFU/mL。將濾液和空白對照用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調至pH 7.0，以中和有機酸的干擾，再加入終質量濃度為5.0 mg/mL的過氧化氫酶，于37 ℃水浴2 h，以排除過氧化氫的干擾[17]。在牛津杯（內徑6 mm，外徑8 mm）內加入0.2 mL處理后的濾液和空白對照，36 ℃培養24 h，觀察其是否有抑菌圈。用十字測量法測定其抑菌圈直徑，直徑＞10 mm時判定為有抑菌作用[18]，空白對照應無抑菌圈產生，否則實驗結果無效。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從稀甜醬樣品中共分離得到64株有明顯溶鈣圈的菌株，其中33株革蘭氏染色陽性且接觸酶試驗陰性，初步確定為乳酸菌[13-14]，將其編號為TJ01～TJ33。篩選到的菌株在MRS固體培養基上均呈現為圓形、中央凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊的乳白色菌落。在顯微鏡油鏡下，菌株TJ10和TJ25細胞呈現為單個或呈鏈狀排列的無芽孢革蘭氏陽性桿菌，其他菌株細胞均為單個、成對、四聯、成鏈或成片出現的革蘭氏陽性球菌。部分代表菌株的革蘭氏染色鏡檢結果見圖1。

圖1 12株代表菌株的革蘭氏染色結果Fig.1 Gram staining results of 12 representative strains

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

將33株乳酸菌接種于MRS瓊脂培養基，于36 ℃厭氧培養24 h。乳酸菌在厭氧培養條件下均能正常生長，說明分離得到的菌株均為兼性厭氧菌。部分代表菌株的生理生化特征和碳源利用試驗結果分別見表1和表2。

表1 12株代表菌株的生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of 12 representative strains

表2 12株代表菌株的碳源利用試驗結果Table 2 Results of carbon sources utilization tests of 12 representative strains

續表

由表1及表2可知，菌株TJ10和TJ25均為接觸酶陰性、不產生H2S、pH 4.5條件下能夠生長的兼性厭氧桿菌，初步鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。菌株TJ07和TJ26代謝葡萄糖產酸產氣、15 ℃生長、45 ℃不生長，初步鑒定為魏斯氏菌屬（Weissella）。菌株TJ05、TJ08、TJ15和TJ23代謝葡萄糖產酸不產氣，在15 ℃、45 ℃、6.5%NaCl和pH 9.6條件下均可以生長，初步鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）；菌株TJ04、TJ12、TJ17和TJ31代謝葡萄糖產酸不產氣，在18%NaCl中不能生長，初步鑒定為片球菌屬（Pediococcus）。碳源利用試驗結果和生理生化鑒定結果有一定的匹配性，大多初步鑒定為同屬的代表菌株表現出相同或相似的碳源利用能力。結合生理生化特征和碳源利用試驗情況，其他21株菌株的初步鑒定結果見表3。

表3 基于生理生化試驗21株菌株的初步鑒定結果Table 3 Preliminary identification results of 21 strains based on biochemical and physiological tests

2.3 乳酸菌的分子生物學鑒定

將分離得到的33株乳酸菌的16S rRNA序列結果在NCBI上進行Blast相似性分析，選擇同源性較高的菌株的16S rRNA序列，以鄰接法構建系統發育樹，結果見圖2。

圖2 基于16S rRNA序列33株乳酸菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 33 strains of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由圖2可知，菌株TJ01、TJ02等15株菌株與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為屎腸球菌；菌株TJ04、TJ06等12株菌株與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為乳酸片球菌；菌株TJ07、TJ09等4株菌株與類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為類腸膜魏斯氏菌；菌株TJ10和TJ25與酸魚乳桿菌（Lactobacillus acidipiscis）處于同一分支，相似度均為100%，鑒定為酸魚乳桿菌。由此得出，稀甜醬中分離得到的屎腸球菌和乳酸片球菌數量最多，分別占總分離乳酸菌數的45.5%和36.4%，為優勢乳酸菌。

2.4 乳酸菌發酵濾液的抑菌活性

乳酸菌的發酵濾液中往往含有較多的乙酸、乳酸、過氧化氫等有抑菌效果的代謝產物[19-20]，本試驗通過調節pH和加入過氧化氫酶排除以上干擾因素[17]，測定33株乳酸菌發酵液的抑菌活性，結果顯示，空白對照未產生抑菌圈，33株乳酸菌僅有菌株TJ17和TJ31具有抑菌活性，其抑菌圈直徑見表4。

表4 乳酸菌TJ31和TJ17發酵濾液對指示菌的抑制作用Table 4 Antibacterial activity of fermented filtrate of lactic acid bacteria strains TJ31 and TJ17

由表4可知，乳酸菌TJ17和TJ31發酵液對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌以及大腸埃希氏菌均有一定的抑制作用，且乳酸菌TJ31的抑菌效果強于菌株TJ17，但都對枯草芽孢桿菌無抑制作用。

菌株TJ17和TJ31經鑒定為乳酸片球菌。近年來，乳酸片球菌的益生活性[21]引起廣泛關注，而抑菌能力是乳酸片球菌的重點研究內容之一。有研究表明，來源于片球菌屬的細菌素（bacteriocins）類物質對單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有著強烈的抑制作用[22]，本實驗中的乳酸片球菌發酵產物對上述兩種致病菌的抑制作用也較為明顯，因此，值得對其有效抑菌成分開展進一步研究。

3 結論

利用經典乳酸菌篩選法從揚州稀甜醬中共分離得到33株乳酸菌，經形態學、生理生化和16S rRNA序列分析，鑒定15株為屎腸球菌（E.faecium）、12株為乳酸片球菌（P.acidilactici）、4株為類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）、2株為酸魚乳桿菌（L.acidipiscis），其中屎腸球菌和乳酸片球菌分別占總分離乳酸菌數的45.5%和36.4%，為稀甜醬中的優勢乳酸菌。乳酸片球菌TJ17和TJ31發酵濾液對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌和大腸埃希氏菌均有明顯的抑制作用，且乳酸片球菌TJ31抑菌效果較好。