陶融型酒醅中產香芽孢桿菌的篩選、鑒定及發酵產物分析

陳蒙恩 ，李建民，韓素娜，樊建輝，邢星月，王曉毅，李 華，胡曉龍

（1.河南仰韶酒業有限公司，河南 三門峽 472400；2.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

中國白酒歷史悠久、工藝獨特、香型多樣[1-3]，且香型明顯的地域特征本質上都是當地自然條件與物質條件在釀酒過程中的綜合反映[4]。仰韶地處中原，獨特的自然環境和微生態體系，造就了陶融型白酒“醹、雅、融”的風格特點[5]。近年來，隨著對中國白酒科研的深入發展，釀酒功能微生物已成為科研人員的研究重點，其中對芽孢桿菌的相關研究被多次報道[6-9]。

芽孢桿菌是中國白酒釀造過程中的重要功能微生物，其繁殖代謝過程中能分泌白酒釀造中所需的酯化酶、蛋白酶等相關酶系，從而使釀酒原料在白酒釀造過程中產生種類眾多的風味物質[10-11]，這些物質對不同香型白酒的典型風格特點起著關鍵作用[12-14]。因此，篩選并應用具有優良性能的芽孢桿菌，對于構建白酒微生物菌種資源庫及實現名優酒企異地復建具有重要意義[10，15]。王西等[16]從醬香型高溫大曲中篩選到一株高產四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；鐘姝霞等[17]從醬香型酒醅中篩選到5株性能獨特的芽孢桿菌；吳樹坤等[7]從沉香型酒醅中篩選到4株具有產香功能的芽孢桿菌；王霜等[3]從濃醬兼香型酒醅中篩選到2株具有高堿性蛋白酶活力，且對乙醇具有高耐受性的芽孢桿菌；但目前對陶融型酒醅中產香芽孢桿菌的相關研究尚未見報道。

本研究以陶融型酒醅為研究對象，利用傳統微生物篩菌方法，對出窖酒醅中的芽孢桿菌進行分離純化[18]，同時進行固態發酵產香試驗，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）[19-20]對香味成分突出的發酵產物進行分析，并對其相應的菌株進行形態學、生理生化特征分析和16S rDNA基因序列鑒定[21]、耐受性分析，為探尋功能微生物與陶融型白酒風味成分之間的內在關聯，找到產香性能獨特、突出的芽孢桿菌，進一步優化陶融型白酒釀造功能菌群，提高陶融型白酒品質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

酒醅樣品采集于河南仰韶酒業有限公司，對不同車間、不同窖池的出窖酒醅進行取樣，將取樣窖池分為上、中、下3層進行，將3層酒醅樣品混合均勻作為一個分析樣品，冰盒運回，-20 ℃保藏備用。

1.1.2 培養基

營養瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

種子培養基[12]：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨5 g/L，牛肉浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，納他霉素1 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

高粱小麥固體培養基[21]：取100 g高粱和100 g小麥，經適度粉碎充分混勻，加入總質量37%的蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：大連寶生物工程有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、BioSpin試劑盒：西安熱摩爾公司；T-19載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞：日本TAKARA公司；DNA快速抽提試劑盒、葡萄糖、NaCl、胰蛋白胨、牛肉浸粉、瓊脂粉、淀粉、明膠、纖維素、麥芽糖、棉子糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖：上海生物工程股份有限公司。所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；DHG-9123A型電熱鼓風干燥箱、DHP 9272型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-VS2型超凈工作臺：無錫易純凈化設備有限公司；VEGA 3 SBU型掃描電子顯微鏡：德國NETZSCH公司；TGL-20M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；K960PCR熱循環儀：杭州晶格科學儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀、WD-9403C型紫外儀：北京六一生物科技有限公司；Trace1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀：美國Thermo Fishier公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒醅中芽孢桿菌的分離及純化[22-23]

準確稱取10g酒醅樣品，無菌操作下迅速倒入裝有90mL無菌生理鹽水的三角瓶中，充分搖勻，80 ℃水浴60 min，然后逐級稀釋至10-5。取10-3、10-4、10-5三個梯度的菌懸液分別涂布在營養瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h。待長出菌落后，挑選芽孢桿菌單菌落進行劃線分離、純化，試管斜面4 ℃保藏。

1.3.2 產香芽孢桿菌的篩選

將純化的芽孢桿菌分別接入種子培養基中，37 ℃條件下培養18 h，調節種子液濃度至108CFU/mL，按5%的接種量接種于高粱小麥固體培養基中，裝料量為130 g/500 mL，37 ℃條件下培養7 d[12]。由5名國家級白酒評委和5名省級白酒評委組成評價小組，對各菌株的發酵產物進行感官評價[12，17]，并采用HS-SPME-GC-MS對香味突出的發酵產物中的揮發性成分進行檢測[17]。具體方法如下：

頂空固相微萃取條件：精確稱取3.0 g發酵產物于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵化10 min，萃取40 min；進樣口溫度設為260 ℃，解吸2 min后自動進樣，進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-FFAP毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；260 ℃條件下自動不分流進樣；升溫程序為35 ℃保持3 min，5 ℃/min升至100 ℃、保持3 min，5 ℃/min升至150 ℃、保持3 min，10 ℃/min升至230 ℃、保持3 min；載氣為高純度氦氣（He），流速為1.00 mL/min。

質譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃，掃描范圍30～550 u。

定性半定量：將芽孢桿菌固態發酵產物的揮發性風味物質質譜圖與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標準譜庫進行對比鑒定，匹配度＞800的鑒定結果予以確認。以薄荷醇（2.5 μg/g）為內標進行半定量。

1.3.3 菌株鑒定

（1）形態觀察

對篩選得到的菌株的菌落形態、革蘭氏染色結果等進行觀察記錄；同時，對其菌體形態進行電鏡觀察，并根據《伯杰細菌鑒定手冊》[24]完成形態學鑒定。

（2）生理生化試驗

針對芽孢桿菌菌種特性，設計明膠液化、碳源利用、淀粉水解、硝酸鹽還原和纖維素分解等生理生化試驗[25]，進行觀察和記錄。

（3）分子生物學鑒定

采用引物799F（5'-AACAGGATTAGATACCCT-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對篩選得到的菌株進行16S rDNA分子生物學鑒定[26-27]。將PCR擴增產物委托上海杰李生物技術有限公司進行測序，所得序列提交至美國國立生物技術信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST比對檢索[28-29]，利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹[30-31]。

1.3.4 菌株耐受性分析

將產香芽孢桿菌接種于營養瓊脂培養基中，于不同溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、53 ℃、55 ℃）下進行培養，觀察菌落生長狀況，檢測其對溫度的耐受性。

將產香芽孢桿菌分別接種于不同酒精度（1%vol、2%vol、4%vol、6%vol、8%vol）、pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、NaCl含量（2%、4%、6%、8%、10%）的營養瓊脂培養基中，于37 ℃條件下恒溫培養，檢測其對酒精度、pH值、NaCl的耐受性。

2 結果與分析

2.1 陶融型酒醅中芽孢桿菌分離結果

將分離到的菌株菌落，通過多次劃線純化，最終從陶融型酒醅中共分離得到11株芽孢桿菌，編號為YSB01～YSB11。

2.2 芽孢桿菌固態產香試驗結果

11株芽孢桿菌固態發酵產物的感官評價結果見表1。

表1 11株芽孢桿菌固態發酵產物的感官評價結果Table 1 Sensory evaluation results of solid-state fermentation products of 11 strains of Bacillus sp.

由表1可知，11株芽孢桿菌固態發酵產物的感官特征各異，其中菌株YSB11經過37 ℃發酵7 d后，菌體在培養基上長勢良好，培養基呈紅褐色，其發酵產物具有濃郁的焦糊香味和醬香味，其他菌株發酵產物雖有香味，但香味均不突出。綜合評定，菌株YSB11可作為本次篩選的目標菌株。進一步采用HS-SPME-GC-MS對菌株YSB11固態發酵產物的揮發性成分進行分析，結果見圖1及表2。

圖1 菌株YSB11固態發酵產物揮發性物質分析GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile substances in the solid-state fermentation products by strain YSB11 analyzed by GC-MS

表2 菌株YSB11固態發酵產物揮發性物質測定結果Table 2 Determination results of volatile substances in the solid-state fermentation products by strain YSB11

由表2可知，通過HS-SPMEP-GC-MS從菌株YSB11固態發酵產物中共檢測到28種微量揮發性風味成分，含量最高的化合物為酚類物質，且以2-甲氧基苯酚為主，占26.27%，酚類化合物呈香閾值低，是酒體中水果香、辛香、丁香等風味的重要來源[32]；吡嗪類化合物共檢測到4種，占15.11%，這類化合物香味閾值低、香勢強，具有烘焙和堅果的香氣，賦予酒體醹雅、柔順的風格[33]；呋喃類化合物檢測到2種，占18.51%，呋喃類是白酒中的重要風味化合物，主要貢獻甜香、焙烤香和青草香等香氣[12，17]；芳香族化合物檢測到3種，其中苯乙醇含量占8.54%，苯乙醇具有香味突出、香勢強、閾值低、風味優雅等特點[34]；酯類物質檢測到11種，占18.78%，酯類物質是構成中國白酒特有口感的重要呈香呈味化合物。

綜上所述，酵母菌株YSB11具有產酚類、吡嗪類、呋喃類、苯乙醇、酯類等多種香味物質的能力，這些物質對陶融型白酒的風味成分具有重要貢獻作用，因此，可認定菌株YSB11為陶融型白酒的一株重要產香功能菌。

2.3 菌株YSB11的鑒定

2.3.1 形態觀察

將菌株YSB11劃線接種于營養瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養48 h，其菌落及細胞形態見圖2。

圖2 菌株YSB11的菌落（a）及細胞形態（b、c）Fig.2 Colony (a) and cell (b,c) morphology of strain YSB11

由圖2可知，菌株YSB11在營養瓊脂培養基上的菌落直徑為2～3 mm，淺白色，菌落邊緣呈鋸齒狀、正反面顏色一致、較干燥、無黏性、易挑取，革蘭氏染色呈藍紫色，即革蘭氏陽性菌，細胞體呈棒狀。

2.3.2 生理生化試驗

菌株YSB11的生理生化試驗結果見表3。

表3 菌株YSB11的生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of strain YSB11

由表3可知，菌株YSB11具有淀粉水解、明膠液化、硝酸鹽還原能力，同時具有利用纖維素、D-木糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖4種碳源進行生長代謝能力。結合形態觀察結果，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[24]，初步判定菌株YSB11為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.3.3 分子生物學鑒定結果

將菌株YSB11的16S rDNA PCR擴增產物測序結果提交至GenBank數據庫中進行Blast搜索比對發現，菌株YSB11與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）MH370470.1的16S rDNA序列相似性為100%。選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 7.0.26軟件中的NJ法構建菌株YSB11的系統發育樹，結果見圖3。

圖3 基于16S rDNA序列菌株YSB11的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YSB11 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株YSB11與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）MH370470.1聚于一支，親緣關系最近。結合菌株YSB11的形態觀察、生理生化試驗結果，鑒定菌株YSB11為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensiss）。

2.4 菌株YSB11的耐受性試驗結果

對白酒釀造過程中產香芽孢桿菌及其耐受性進行研究，有助于認識白酒生產過程中產香微生物對原料的作用機制，對進一步認識陶融型白酒生產過程中淀粉、蛋白質等大分子物質的生化代謝及特征風味物質的形成機理有著至關重要的指導意義。菌株YSB11對溫度、酒精度、NaCl含量及pH值的耐受性結果見表4。

表4 菌株YSB11耐受性試驗結果Table 4 Tolerance tests results of strain YSB11

由表4可知，菌株YSB11的最高耐受溫度為53 ℃，說明在相對高溫的條件下也可進行正常生長代謝，耐高溫菌株是大曲生產和白酒釀造過程中的關鍵微生物之一；菌株YSB11對NaCl含量的最大耐受度為8%，對最低pH值的耐受度為6.0，對乙醇的最高耐受度為6%vol，說明菌株YSB11在白酒釀造末期極端環境下仍具有極強的生存能力，可繼續代謝產香。

3 結論

本研究從陶融型酒醅中共分離純化得到11株產香芽孢桿菌，經固態產香試驗篩選發現，菌株YSB11的固態發酵產物具有濃郁的焦香、糊香和醬香味，通過HS-SPME-GC-MS分析發現，菌株YSB11固態發酵產物中風味物質種類豐富，包含酚類、吡嗪類、呋喃類、芳香類、酯類等多種白酒中重要呈香物質，這些物質在陶融型白酒風味物質的組成中占有重要地位。通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術，鑒定菌株YSB11為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensiss）。菌株YSB11具有較好的耐受性，可耐高溫53 ℃、酒精度6%vol、NaCl含量8%及低pH值6.0。