不同原料醬油抗氧化活性生物測試及風味分析

鐘小廷，呂 杰，易謙武，劉迎濤，俞航萍，李 可*

（1.四川新希望味業有限公司，四川 成都 610000；2.成都國釀食品股份有限公司，四川 成都 610000；3.杭州環特生物科技股份有限公司，浙江 杭州 310051；4.四川農業大學，四川 雅安 625014）

隨著《國民營養計劃（2017-2030年）》的實施，“健康中國”已成為國家戰略。天然、健康、功能已經成為消費者選擇食品的最大關注，越來越多的消費者出于健康目的而重視植物基化學成分的攝入[1]。醬油中不僅含有大豆原料中的不飽和脂肪酸、多糖、大豆異黃酮、大豆多肽、大豆皂苷等物質，還包括經微生物代謝產生的多肽、類黑精、呋喃酮類物質等[2-7]。已有研究表明，醬油具有抗氧化、降血壓、降血脂、降低膽固醇、抗癌、抗過敏等功能活性[8-10]。由此可知，醬油不僅僅是調味品，同時也是消費者攝取植物化學成分的重要載體，消費者可以通過日常生活實現植物化學成分的攝入。因此，通過改變傳統發酵醬油用原料、發酵工藝等方式來提升醬油品質，強化營養與安全是醬油產品的創新點之一。

黑豆含有的不飽和脂肪酸、食物纖維、微量元素、黃酮、類黃酮化合物及獨特的生物活性物質，具有抗氧化、降血壓、降血脂、延緩衰老、增強免疫力、改善睡眠等保健作用[11-13]。此外，有研究表明黑豆蛋白質[14]、維生素、總酚及種皮含有的花青素和花色苷類物質含量高于黃豆[15]，故而賦予了黑豆更高的抗氧化活性。王猛[16]研究表明，黑豆醬油中花色苷含量為0.217 g/100 mL；王鵬等[17]研究表明，采用黑豆為原料發酵的醬油原花青素含量為24.2 mg/100 g；張歡歡等[18]比較了黑豆醬油與黃豆醬油的基本成分、抗氧化活性及風味物質，結果顯示黑豆醬油體外抗氧化活性顯著高于黃豆醬油。然而由于體外抗氧化分析結果往往與體內真實抗氧化作用沒有直接聯系，且基于體內抗氧化試驗比較不同原料釀造醬油尚未見報道。

本研究以市售的黑豆、黃豆和黃豆粕原料發酵的醬油為研究對象，通過斑馬魚體內抗氧化試驗，分析比較3種醬油的抗氧化活性；采用電子鼻（electronic nose，E-nose）、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）結合主成分分析（principal component analysis，PCA）等分析比較不同原料醬油揮發性風味特征，為醬油的配方、發酵工藝優化與市場推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆醬油（1#，配料表：水、非轉基因黑大豆、食用鹽、小麥）、黃豆醬油（2#，配料表：水、非轉基因黃豆、小麥、食用鹽）、黃豆粕醬油（3#，配料表：水、非轉基因脫脂大豆、小麥、食用鹽、白砂糖）：市售；谷胱甘肽（glutathione，GSH）、活性氧族物質（reactive oxygen species，ROS）特異性熒光染料：美國Sigma公司；AB品系斑馬魚、CM工作液、E3工作液：杭州環特生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S型萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；96孔酶標板：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Mithras LB940多功能酶標儀：德國Berthold Technologies（伯托）公司；PEN 3.5系統便攜式電子鼻：德國Airsense公司；Agilent Intuvo 9000氣相色譜儀、Agilent 5977B氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同原料醬油體內抗氧化作用測定[19-21]

醬油抗氧化作用濃度的確定：在顯微鏡下挑選發育一致3dpf的AB系斑馬魚10尾于微孔板中，水溶給樣，每組進行3次平行試驗。正常對照組用標準稀釋水處理正常斑馬魚；處理組設置醬油樣品1#、2#、3#的檢測濃度均為0.001%、0.003%、0.010%、0.030%、0.100%、0.300%，培養24 h后，觀察斑馬魚的死亡情況，確定3個醬油樣品抗氧化作用的試驗濃度。

醬油體內抗氧化作用：在顯微鏡下挑選發育一致3dpf的AB系斑馬魚10尾于微孔板中，水溶給樣。試驗設計見表1。

計算抗氧化活性，其計算公式如下：

式中：F正常組表示正常對照組的熒光值，F底物表示底物對照組的熒光值，F實驗組表示各處理組的熒光值。

表1 醬油體內抗氧化試驗設計Table 1 Experimental design of antioxidant effect of soy sauce in vivo

1.3.2 不同原料醬油電子鼻分析[22]

分別準確吸取5 g不同醬油樣品于40 mL樣品瓶中，室溫下靜置30min后，采用頂空抽樣的方法用電子鼻進行檢測。電子鼻參數設置：樣品準備時間5 s，自動調零時間為5 s，樣品測定時間120 s，清洗時間150 s，內部空氣流速300 mL/min，進樣流量300 mL/min。電子鼻不同傳感器對應物質種類見表2。選取120～122 s檢測數據進行主成分分析。

表2 電子鼻不同傳感器對應物質種類Table 2 Corresponding aroma types of different sensors of electronic nose

1.3.3 不同原料醬油揮發性風味物質GC-MS分析[18]

頂空固相微萃取：分別取5 g不同醬油樣品于20 mL頂空固相微萃取瓶中，40 ℃平衡20 min，采用50 μm CAR/DVB/PDMS萃取頭萃取30 min。

GC條件：DB-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），載氣流速為1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，解吸時間5 min。升溫程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min速率上升至180 ℃，以4 ℃/min升溫至220 ℃保持5 min，以4 ℃/min速率升溫至240 ℃保持3 min，最后以10 ℃/min速率升溫至250 ℃保持5 min。

MS條件：接口溫度280 ℃，電子轟擊離子源（electron impact ion source，EI），電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍質核比（m/z）35～500 u。采用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）2017譜庫檢索進行定性分析，采用面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

1.3.4 數據處理

每個樣品做3個平行，結果取平均值。描述性統計值以“平均值±標準差”表示，電子鼻測定結果采用自帶軟件對傳感器采集數據進行PCA；GC-MS數據采用Origin 2019 Pro軟件進行PCA。

2 結果與分析

2.1 不同原料醬油抗氧化作用比較

2.1.1 不同原料醬油抗氧化作用實驗濃度的選擇

分別經不同濃度的3種醬油處理斑馬魚后，斑馬魚的死亡率見表3。

表3 不同濃度的3種醬油樣品處理后斑馬魚的死亡率Table 3 Death rate of zebrafish treated by different concentration of three soy sauce samples

由表3可知，正常對照組斑馬魚的死亡率為0，1#、2#、3#醬油樣品分別在0.30%、0.10%、0.30%濃度條件下導致斑馬魚死亡，致死率分別為10%、50%和20%。因此，本研究選擇醬油抗氧化實驗濃度分別為：1#和3#醬油樣品為0.010%、0.030%和0.100%；2#醬油樣品為0.003%、0.010%和0.030%。

2.1.2 不同原料醬油體內抗氧化活性對比分析

通過斑馬魚實驗比較了黑豆醬油、黃豆醬油、黃豆粕醬油的體內抗氧化活性，結果見圖1，3種醬油濃度為0.030%時對斑馬魚抗氧化作用的熒光圖結果見圖2。

由圖1和圖2可知，1#醬油樣品抗氧化活性最強，在0.010%和0.030%濃度條件下抗氧化活性與80 μmol/L谷胱甘肽陽性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）。在相同濃度條件下，1#醬油樣品與2#、3#相比較均存在顯著差異性（P＜0.05），而2#、3#醬油樣品在相同濃度（0.010%、0.030%）條件下抗氧化活性無顯著差異（P＞0.05）。以上研究結果表明，黑豆醬油的抗氧化效果優于黃豆醬油和豆粕醬油。

圖1 3種醬油樣品的體內抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity in vivo of three soy sauce samples

圖2 濃度為0.03%的3種醬油樣品對斑馬魚抗氧化活性熒光圖Fig.2 Fluorescent diagram of the antioxidant activity of three soy sauce samples with concentration 0.03% on Zebrafish

此外，通過比較同一樣品不同濃度抗氧化活性可知，1#、3#醬油樣品在0.010%和0.030%濃度條件下，2#醬油樣品在0.003%、0.010%和0.030%濃度條件下均表現出抗氧化活性，而高濃度0.100%條件下的抗氧化作用低于低濃度的抗氧化作用，可能是由于所選濃度在斑馬魚抗氧化模型上已達到最大能效濃度。結合2.1.1部分結果可知，0.100%濃度接近致死劑量，可能是高濃度條件下對斑馬魚的生存造成了脅迫，促使斑馬魚機體出現毒性反應，產生大量ROS，使得ROS水平較高，檢測的抗氧化活性反而更低。該結果也從一定程度上反映了0.010%和0.030%為最大能效濃度。

2.2 不同原料醬油風味電子鼻分析

選擇電子鼻120～122s的檢測數據進行PCA，結果見圖3。

由圖3可知，PC1和PC2貢獻率分別為99.49%和0.46%，合計貢獻率為99.95%。所以這兩個成分能夠較好代表樣品風味的主要信息特征。3種醬油樣品95%置信區彼此分開，說明3種醬油風味特征有顯著差異。其中，黃豆醬油與豆粕醬油、黑豆醬油相比較，沿PC1正半軸移動較大，沿PC2軸移動較小，且在PC2軸上黃豆醬油與豆粕醬油、黑豆醬油均有重疊。黑豆醬油與豆粕醬油相比，在PC1軸無差異，而在PC2正軸移動較大，且存在顯著差異。黃豆醬油與豆粕醬油、黑豆醬油的區分度分別為0.955和0.954，黑豆醬油與豆粕醬油的區分度為0.114，說明3種醬油風味特征有顯著差異，且黃豆醬油與豆粕醬油、黑豆醬油之間的區分度更高。

圖3 基于電子鼻分析結果醬油風味主成分分析Fig.3 Principal component analysis of electronic nose of soy sauce flavor

3種醬油樣品不同傳感器載荷分析見圖4。由圖4可知，對主成分1貢獻率較大的為W5S（氮氧化合物），結合圖2可知，黃豆醬油與黑豆醬油、豆粕醬油風味特征差異主要體現在含有較高含量的氮氧化合物，而黑豆醬油和豆粕醬油在W5S傳感器上無顯著差異。對主成分2貢獻率較大的是W1W（無機硫化物）、W2S（醇類）、W1S（甲基類），且特征值均為正。因此，與黑豆醬油相比較，豆粕醬油無機硫化物、醇類和甲基類物質的含量可能相對較高。

圖4 3種醬油樣品不同傳感器載荷分析圖Fig.4 Sensors loading analysis of three soy sauce samples

2.3 不同原料醬油中揮發性風味物質分析

2.3.1 不同原料醬油中揮發性風味物質GC-MS分析

電子鼻能在一定程度上對風味進行定性分析，能將風味差異定位到某類揮發性組分。為進一步了解3種醬油揮發性成分的變化，采用GC-MS對醬油中揮發性物質的種類進行檢測，并采用面積歸一化法計算各組分相對百分含量，結果見表4。

表4 3種醬油樣品揮發性風味物質組成Table 4 Volatile flavor components of three soy sauce samples

由表4可知，從3種醬油樣品中共鑒定出33種揮發性風味成分，包括醇、醛、酸、酯、酚、酮及雜環類化合物，相對含量由高到低依次為醇（84.18%～88.67%）、雜環類化合物（5.52%～6.87%）、醛（3.30%～4.69%）、酚（0～2.97%）、酸（0～2.58%）、酯（0.42%～0.77%）、酮（0.09%～0.48%），受發酵工藝和檢測方法的影響，該研究結果與其他研究結果有一定差異性[18，22]。根據本研究結果，豆粕醬油、黑豆醬油、黃豆醬油中分別鑒定出20種、24種和23種揮發性風味成分，3種醬油樣品中共有成分為12種。其中豆粕醬油中乙醇和苯乙醇含量相對較高，相對含量分別為82.07%、4.88%，均為酵母發酵產物，為醬油的主體成分。黃豆醬油中苯乙醇和4-乙基愈創木酚相對含量較豆粕醬油和黑豆醬油高，這兩種物質主要由酵母產生且對醬油風味有較大貢獻，對醬油特征風味的形成有較大影響[23-24]。黑豆醬油中呋喃甲醇和2-乙酰基吡咯含量較豆粕醬油和黃豆醬油高，其中2-乙酰基吡咯呈香豆素香氣，還有茶味香味、甜味[24]，也對醬油特征風味的形成有較大影響。

2.3.2 不同原料醬油中揮發性物質PCA分析

對3種醬油樣品中的33種成分進行主成分分析，結果見圖5和表5。

圖5 3種醬油樣品揮發性物質主成分分析Fig.5 Principal component analysis of volatile substances in three soy sauce samples

由圖5可知，PC1和PC2貢獻率分別為62.0%和26.1%，累積貢獻率為88.1%，說明這兩個主成分能代表33種物質的主要信息。由圖5亦可知，3種醬油分布置信區域均有一定重疊，說明3者之間風味物質沒有顯著差異性。3者之間黑豆醬油與黃豆醬油、豆粕醬油之間的差異較大，黃豆醬油與豆粕醬油之間差異較小。黑豆醬油與黃豆醬油、豆粕醬油分布在PC1軸上移動較大，說明黑豆醬油與黃豆、豆粕風味物質在PC1方向有較大差異。結合表5可知，PC1主成分特征值向量較大的有環丙烷羧酸、苯乙醇及11種雜環化合物，其中正向量包括環丙烷羧酸、2-乙基-3甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、對羥苯甲醚、3,4,4-三甲基-2-環戊烯-1-酮、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、鄰苯二甲酸二甲酯、5-甲基-2-苯基-2-己醛，負向量有2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基-4-氨基吡啶、3,5-二甲基-4-烯丙基吡唑、苯乙醇、2,5-二甲基3-（3-甲基丁基）吡嗪等。由此可知，以上13種化合物是造成黑豆醬油與黃豆醬油、豆粕醬油差異的主要物質，且黑豆醬油特征風味物質主要為雜環類化合物（正值），而黃豆與豆粕醬油特征風味物質有苯乙醇及雜環類化合物（負值）。通過比較PC2對3種醬油差異的影響可知，3者存在一定差異性。結合表4可知，3者之間差異的物質還包括乙醇、異戊醇、丁二酸二乙酯、2-異戊-6-甲基吡嗪、2-苯基-2-丁烯醛、4-乙基愈創木酚、2-環己基-環己酮等。

表5 主成分PC1、PC2各因子載荷表Table 5 Factor loading table of main components PC1 and PC2

綜合電子鼻及GC-MS分析結果可知，黑豆醬油與黃豆醬油、豆粕醬油在物質組成和風味特征上均有較大差異，豆粕醬油醇類物質含量最為豐富，黃豆醬油中芳香族化合物含量較為豐富（苯乙醇和4-乙基愈創木酚含量相對較高），而黑豆醬油中呋喃類、吡咯類物質含量相對較高。由此可知，發酵過程中的酵母對豆粕醬油和黃豆醬油風味物質的產生有較大貢獻，使得黃豆醬油和豆粕醬油的風味更加豐富、協調。而黑豆醬油中的風味物質更多是在加熱過程中產生，醇香味突出，但醬香味較為寡淡。黃豆醬油和豆粕醬油雖然在呈味特征上有顯著差異，但物質組成上差異較小。兩種分析結果差異性主要是源于電子鼻分析結果主要體現的是呈味特征的結果，而揮發性物質PCA體現的是物質組成。產品的風味特征是由物質組成和呈味特性共同決定的，由揮發性物質PCA分析可知，PC1和PC2特征值較大的向量主要為雜環類化合物，這些物質具有呈味閾值低，對醬油風味影響大的特點[18]，因此這些物質可能是造成兩者風味差異較大的原因。

3 結論

本研究分析比較了以黃豆粕、黑豆、黃豆為原料的三種市售醬油的抗氧化活性、風味特征及風味物質組成。結果表明，黑豆醬油的體內抗氧化活性顯著高于黃豆醬油和豆粕醬油（P＜0.05），在0.01%和0.03%濃度下，黑豆醬油的抗氧化作用分別為66.0%和68.5%；黃豆醬油的抗氧化作用分別為38.5%和39.3%；黃豆粕醬油的抗氧化作用分別為38.4%和41.5%。黑豆醬油的揮發性物質組成和特征香氣與黃豆醬油、豆粕醬油存在較大差異，風味特征差異主要表現為：三者相比氮氧化合物是黃豆醬油特征風味，無機硫化物、W2S醇類、W1S甲基類是豆粕醬油的特征風味，而黑豆醬油特征風味物質主要為雜環類化合物。揮發性風味物質組成差異表現為：黑豆醬油中2-乙酰基吡咯含量較高，豆粕醬油中乙醇和苯乙醛含量相對較高，而黃豆醬油中苯乙醇、4-乙基愈創木酚等重要風味物質相對含量較高，以上具有明顯差異的香氣成分幾乎都為釀造過程中微生物發酵代謝產生，由此推斷可能是由于醬油發酵工藝的差異而帶來了風味物質成分在組成和含量上的不同。