馬克斯克魯維酵母的中試發酵研究

肖澤濤，李 嘯， *，張小龍，葉 晗，談亞麗，裴宇鵬

（1.三峽大學 生物與制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省酵母功能重點實驗室 安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）是一種能夠利用乳糖進行生長的酵母，因此該酵母一般能夠從乳源中分離出來[1-2]。馬克斯克魯維酵母不僅生長迅速、耐熱性高、底物譜廣以及能產生多種酶[3-6]，而且具有通常被認為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）的認證地位[1]。2013年該酵母被中國國家衛生和計劃生育委員會批準為新食品原料[7-8]。由于馬克斯克魯維酵母具有以上這些特性，并且該酵母在某些營養特性方面與釀酒酵母類似[9]，因此有望代替釀酒酵母利用廉價廢棄物進行食品工業的生產。這就有必要對其生長特性進行深入研究。

Crabtree效應是指即使是在有氧條件下，較高的糖濃度也會使酵母細胞由呼吸型向發酵型（產乙醇）轉變，也就是高速同化葡萄糖而引起的好氧呼吸阻遏作用[10]。Crabtree效應不利于酵母細胞進行有氧呼吸，會影響細胞的生長，并且乙醇對酵母菌的生長有較大的抑制作用[11]。值得注意的是，雖然馬克斯克魯維酵母被歸類為Crabtree陰性菌株[12-13]。但是有報道指出該酵母確實攜帶有通過發酵生產乙醇所必需的基因[1]，且具有良好的乙醇發酵能力[8，14]。王亮等[15]通過試驗表明，當培養基中糖質量濃度＞65 g/L時，馬克斯克魯維酵母的生長就會受到抑制，因此推測酵母可能受到Crabtree效應的影響。如此看來，文獻中關于馬克斯克魯維酵母的Crabtree效應的報道不一致。因此有必要針對該情況對酵母的生理學特性進行研究。

本研究采用搖瓶分批培養和發酵罐分批培養從6株馬克斯克魯維酵母中篩選出一株生長能力較好的菌株。并進一步研究該菌株的生長和生理特性。在此基礎上選擇合適的補料策略對酵母進行補料分批培養以實現細胞的大量積累，對馬克斯克魯維酵母的產業化具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）A#、B#、C#、D#、E#、F#：由安琪酵母菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）培養基[16]：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%。115 ℃滅菌20 min。

分批發酵培養基：葡萄糖6%，酵母浸粉1.2%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.3%，MgSO40.03%。pH5.5，115℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

FUS-50 L型新概念發酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的馬克斯克魯維酵母菌株接入裝液量為20 mL/250 mL YEPD培養基中進行初次復壯，30 ℃、160 r/min條件下[15]培養20 h。再將初次復壯后的菌液接入分批發酵培養基作種子液。接種量10%，30 ℃、160 r/min條件下培養10 h。若是種子液用量較大，如用于發酵罐上的研究，則按相同的培養條件進行適當擴培。

1.3.2 搖瓶篩選試驗

按10%的接種量分別將6株馬克斯克魯維酵母的種子液接入裝液量為45 mL/250 mL分批發酵培養基中進行搖瓶分批培養，在30 ℃、160 r/min條件下培養18 h[15]。培養結束后測定細胞干質量（g/L），以細胞干質量為指標篩選出生長能力較好的菌株用于后續試驗。

1.3.3 在3 L發酵罐中的分批培養

將酵母種子液按10%接種量接入裝有1.8 L分批發酵培養基的3 L發酵罐中進行分批培養，培養條件為溫度30 ℃，空氣流量6 L/h，攪拌轉速300 r/min。從0 h開始，每隔1 h取樣，離線測定細胞干質量X、比生長速率μ、發酵液糖濃度和pH，直至細胞生長達穩定期。將各指標進行整理分析，以研究菌株在3 L發酵罐中的分批培養過程。其中比生長速率μ的計算公式如下：

式中：μ為細胞比生長速率，h-1；X為細胞干質量，g/L；t為培養

時間，h；為兩個時間點的細胞干質量的平均值，g/L。

1.3.4 在50 L發酵罐中的分批培養

將酵母種子液按10%接種量接入裝有18 L分批發酵培養基的50 L發酵罐中進行分批培養，培養條件為溫度30 ℃，轉速350 r/min[21]，空氣流量50 L/min，罐壓0.045 MPa。從0 h開始，每隔1 h取樣，離線測定細胞干質量、比生長速率、殘糖、酒精含量，并利用發酵罐配備的pH電極、溶氧電極和尾氣分析儀在線監測發酵液pH、溶氧水平、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）、氧氣攝取速率（oxygen uptake rate，OUR）和呼吸商（respiratory quotient，RQ），直至細胞生長達穩定期。將各指標進行整理分析，以研究菌株在50 L發酵罐的分批培養過程。

1.3.5 馬克斯克魯維酵母的補料分批培養

將酵母種子液按10%接種量接入裝有18 L無菌蒸餾水（培養底水）的50 L發酵罐中進行補料分批培養。結合分批培養研究結果，采用合適的補料策略，流加糖蜜（27.5%）、氨水（16.5%）和磷酸二氫銨（10%）。培養溫度30 ℃，初始發酵液pH值為5.0，初始攪拌轉速200 r/min，空氣流量恒定為50 L/min，罐壓恒定為0.045 MPa。當發酵液體積達發酵罐的工作體積時結束發酵。對發酵液進行離心，對菌體進行洗滌并收集。測定菌體細胞的蛋白質、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、海藻糖、灰分和各氨基酸等組分含量。

1.3.6 分析檢測

細胞干質量測定采用質量法[16]。酒精含量的測定采用馬丁儀滴定法[17]。采用生物傳感器測定發酵液中糖濃度。CER、OUR和RQ等由Biostar 1.5在線分析控制系統計算。相關細胞組分的測定委托安琪酵母檢測中心。

2 結果與分析

2.1 馬克斯克魯維酵母的搖瓶分批培養結果

六株馬克斯克魯維酵母在相同培養條件下的搖瓶生長情況，結果見圖1。

圖1 6株馬克斯克魯維酵母菌株在搖瓶中的分批培養情況Fig.1 Situation of batch culture of 6 strains of Kluyveromyces marxianus in shake flask

由圖1可知，F#菌株的細胞干質量最高，可達（11.21±0.18）g/L。其次是B#菌株，其細胞干質量為（11.08±0.38）g/L。而A#和C#菌株的細胞干質量較低，分別為（9.75±0.18）g/L和（9.51±0.58）g/L。結果表明，菌株B#和F#生長情況較好，因此后續試驗是采用3 L發酵罐對這兩株菌株進行分批培養，研究其培養過程，比較兩株菌的生長情況。

2.2 兩株馬克斯克魯維酵母在3 L發酵罐中的分批培養過程對比

按1.3.3節方法對馬克斯克魯維酵母B#菌株和F#菌株進行分批培養，培養過程各指標變化結果見圖2。

圖2 菌株B#與F#在3 L發酵罐上的分批培養過程曲線Fig.2 Batch culture process curve of strains B#and F#in 3 L fermenter

由圖2可知，在分批培養過程中，B#菌株的比生長速率（μ）在2 h時達到最大，為1.15±0.01，而F#菌株的比生長速率（μ）是在3 h時達到最大，為0.69±0.04。但是在隨后的培養中，由于B#菌株細胞積累較慢，其μ值急劇下降，而F#菌株細胞積累較快，其μ值呈現緩慢下降的趨勢。B#菌株的耗糖速度比F#菌株快，當糖濃度處于較低水平時，發酵液pH開始回彈。菌株F#最終的細胞干質量為（12.96±0.03）g/L，高于菌株B#（11.93±0.04）g/L。因此，菌株F#相比菌株B#在生長方面更具優勢，采用菌株F#進行后續試驗。

2.3 馬克斯克魯維酵母在分批培養過程中的生長特性研究

采用帶有尾氣分析儀的50 L發酵罐按1.3.4節方法對馬克斯克魯維酵母F#菌株進行分批培養，其培養過程各指標的變化見圖3。

由圖3A可知，隨著培養時間的延長，細胞比生長速率逐漸上升，并在培養時間3 h之后達最大值，為0.62±0.17。細胞進入了對數生長期，開始迅速生長。發酵液中糖濃度，pH和溶氧水平快速降低。由圖3B可知，此時CER與OUR數值均較高，表明細胞呼吸強度較高。當發酵液中糖耗完時、pH微微回彈，溶氧水平迅速回升，CER與OUR快速下降，細胞生長進入靜止期，細胞干質量最終達（20.9±0.18）g/L。在葡萄糖沒有被耗完的時間里（0～5 h），CER高于OUR，RQ高于1.26，因此該時期內細胞不是進行完全的有氧呼吸，無氧呼吸強度較高。這導致酒精含量上升，并在5 h后升至較高水平（1.976±0.02）%。因此，馬克斯克魯維酵母F#菌株可能存在Crabtree效應：即較高的糖濃度可能誘發酵母細胞產生酒精，而這種發酵模式不利于細胞的積累。

圖3 菌株F#在50 L發酵罐中的分批培養過程曲線Fig.3 Batch culture process curve of strain F#in 50 L fermenter

為了進一步驗證該菌株是否存在Crabtree效應，后續試驗將選擇合適的補料策略對F#菌株進行補料分批培養，使發酵液中糖濃度既能滿足細胞生長需求，又不至于過高。在這種補料策略下研究細胞生長與酒精產生的趨勢。

目前，有一種常用的補料技術就是根據乙醇的變化控制糖的進料速率，從而避免酵母細胞的Crabtree效應[10，16，18]。然而如果只采用乙醇含量這一離線參數作為主要的控制信號則可能導致補料速率調節的延遲效應，那么就會很容易錯過最佳調控機會[19]。因此還需綜合分析線上參數（RQ、溶氧和pH等），制定更合適的補料策略，才能有效避免這種延遲效應。

2.4 針對馬克斯克魯維酵母Crabtree效應的補料分批培養

采用1.3.5節方法，對F#菌株進行補料分批培養。具體的補料策略如下：①通過監測RQ的變化控制糖的補料速率。在培養前期，當RQ＜1.00時，表明發酵液中糖濃度無法滿足酵母細胞的生長。此時上調糖的補料速率。而RQ＞1.15時，表明酵母細胞無氧呼吸強度較高，這是由發酵液中糖濃度較高引起的，因此適當下調糖的補料速率，使RQ逐漸降至1.00～1.15。另外根據2.3節的試驗結果：培養前期為酵母細胞生長的延滯期，此時酵母對氧氣的需求不大，溶氧水平較高，因此在補料分批培養試驗中，將初始轉速下調為200 r/min。到了培養中期，由于酵母細胞生長較快，耗糖速率開始增加，溶氧水平也會迅速降低，因此逐漸上調糖的補料速率同時上調轉速以滿足酵母生長需要，但仍然以RQ在1.00～1.15為準；②在酵母的培養過程中，發酵液pH會降低，故通過調節氨水的補料速率將pH維持在適合酵母生長的范圍里（4.5～5.5），同時氨水還能作為被酵母利用的氮源；③培養過程中持續補充磷酸二氫銨以滿足酵母對磷源和氮源的需求。有相關報道表明馬克斯克魯維酵母能利用糖蜜進行生長[20]，故本研究采用安琪酵母股份有限公司的糖蜜作為流加碳源，以期對馬克斯克魯維酵母的產業化提供指導。上述所流加的營養物質（糖蜜、氨水與磷酸二氫銨）及其濃度的確定是基于前期相關的工作。培養過程各指標變化分別見圖4和圖5。

圖4 菌株F#在補料分批培養過程中的發酵在線指標Fig.4 Fermentation online indicators of strain F#in the fed batch culture process

由圖4A和圖4B可知，通過這種補料策略，使得RQ盡可能在1.00～1.15。RQ在這個范圍內表明酵母細胞有氧呼吸強度較高，補充的碳氮源剛好可以滿足酵母生長需求，同時又保證發酵液中沒有過多的糖來誘發酵母細胞產酒精。因此發酵液中的糖濃度和酒精含量一直處于低水平（糖質量濃度最高不超過4.5 g/L，而酒精含量也一直處在0.2%vol以內）。再結合上2.3節的試驗結果：糖濃度較高時，發酵液中的酒精含量上升。這表明馬克斯克魯維酵母菌株F#存在Crabtree效應，并且這一補料策略能有效地減弱酵母細胞的Crabtree效應，同時補充的營養源能夠滿足細胞生長需求，細胞干質量一直在上升（見圖5）。

圖5 菌株F#的補料分批培養過程曲線Fig.5 Fed batch culture process curve of strain F#

到了培養中期，隨著細胞生長，溶氧水平顯著降低。5 h以后，發酵液中的溶氧水平較低（見圖4B），此時酵母細胞的呼吸反應速率和生長速率均會受限，因此細胞比生長速率逐漸下降（見圖5）。培養到12 h，發酵液體積達發酵罐的工作體積（33 L），結束培養，最終細胞干質量達（54.37±3.3）g/L。

培養結束后測定菌體的相關組分，結果見表1。由表1可知，細胞中灰分、蛋白質、RNA和海藻糖等含量分別為8.16%、47.41%、7.12%、1.21%，細胞中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量較高，而半胱氨酸和組氨酸含量較低。

表1 菌株F#在補料分批培養后的細胞組分Table 1 Composition of cell after fed batch culture by strain F#

由以上結果可以看出，通過監測RQ的變化控制糖的補料速率以及補充氮源氨水調節pH，不僅可以使酵母細胞大量積累，并且還能有效減弱菌株F#的Crabtree效應。另外與菌株F#的分批培養結果（見2.3節）相比，采用這種補料策略培養菌株F#12 h，細胞干質量提高了160.29%。因此，對于這株菌的高細胞密度培養來說，這種補料策略具有一定的優勢。

3 結論

本研究通過對馬克斯克魯維酵母進行中間試驗，研究培養過程中該酵母的生長情況及相關呼吸參數和代謝產物的變化規律，以實現酵母細胞的大量積累。通過搖瓶和3 L發酵罐的分批培養從6株馬克斯克魯維酵母中確定了F#菌株在生長方面更具優勢，培養后細胞干質量達（11.21±0.18）g/L。采用50 L發酵罐對菌株F#進行分批培養，進一步研究培養過程中酵母細胞的生理代謝變化情況。采用合適的補料策略對F#菌株進行補料分批培養。通過線上監測RQ，pH和溶氧的變化來調控糖蜜，氨水的補料速率以及轉速。不僅滿足了酵母的生長需要，實現細胞大量積累，同時使得發酵液中糖濃度較低，因此酒精含量也低于0.2%。這進一步證明了菌株F#的Crabtree效應。最終培養12 h，細胞干質量達（54.37±3.3）g/L，與菌株F#的分批培養結果相比，細胞干質量提高了160.29%。以廉價營養源實現了馬克斯克魯維酵母細胞的大量積累。本研究針對馬克斯克魯維酵母的Crabtree效應提供了合適的補料策略，對該菌株的工業生產具有一定指導意義。