窖泥酯化菌的富集篩選及其生長條件研究

衛春會，車路萍，汪文鵬，鄧 杰，任志強，黃治國*

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.重慶江記酒莊有限公司，重慶 402260）

濃香型白酒窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協調、尾凈余長，是最受消費者喜愛的白酒之一。濃香型白酒以高粱、大米、玉米等淀粉質谷糧為原料，以中溫大曲為糖化發酵劑，經長時間的泥窖密封發酵后蒸餾而得，其中泥窖密封發酵是形成濃香型白酒風味的過程，也是多種微生物繁衍更替的過程[1-2]。窖泥是濃香型白酒制勝的法寶，也是生產必不可少的基礎，其內含有大量的生香功能菌，這些功能菌代謝產生的有機酸類物質在酯化酶作用下合成的酯類物質是濃香型白酒窖香濃郁的根本[3-4]。因此，加強窖泥中的酯化菌的研究對提升窖內酒醅質量具有重要意義。

目前為止，對窖泥中厭氧微生物的研究已超過幾百種，其中生香功能細菌主要包括己酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌、羧酸菌等[5-7]。王春艷等[8-9]研究發現，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）對濃香型白酒的濃郁窖香具有重要貢獻，其代謝產物主要為己酸和丁酸，同時伴隨一些氫的產生。當甲烷菌與同產己酸的梭菌共生時能有效促進己酸乙酯生成，該研究對復合功能菌液和人工窖泥的改造培養提供了重要理論指導。此外，研究發現，窖池中的酯化菌以芽孢菌為主，岳元媛等[2]對瀘州老窖不同窖齡的窖泥中產香的兼性厭氧菌進行分類計數，發現芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為窖池優勢菌屬，其中大多菌株能產生丁酸和己酸等有機酸；侯小歌等[10]研究發現白酒在發酵中、后期，酒醅中的芽孢桿菌大量增殖，成為優勢菌群，是重要的酯化生香菌。

針對窖泥酯化生香菌微生物多為厭氧芽孢桿菌[11]，本試驗以優質老窖泥為研究對象，厭氧條件下富集酯化菌，并對富集條件進行優化，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographicmass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術對富集液中的酯類物質及其含量進行檢測，確定富集效果；再通過傳統培養分離方法從中篩選產己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，采用形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并研究其生長特性，以期為提高濃香型白酒酒質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

窖泥：無菌操作采集瀘州某名優酒廠老窖池底泥，迅速置于冰盒運回實驗室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養基

富集培養基：乙酸鈉3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉10.0g/L、L-半胱氨酸鹽0.25g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖5.0 g/L、可溶性淀粉1.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、超純水1 000 mL、pH值為6.0±0.1，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

篩選培養基：葡萄糖10 g/L、氯化鈉0.01 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g/L、硫酸錳0.01 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）0.5 g/L、蛋白胨0.1 g/L、酵母膏1.0 g/L、瓊脂20 g/L、三丁酸甘油酯4 mL（在倒平板前加入）、超純水1 000 mL，自然pH值，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。液體培養基中不添加瓊脂。

1.1.3 試劑

乙酸鈉、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鎂、瓊脂、三丁酸甘油酯（均為分析純）、乙酸正丁酯（色譜純）：成都艾科達化學試劑有限公司；EMS、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE壓力蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama公司；BF-2000M氮氣吹濃縮儀：北京八方世紀科技有限公司；LRH-250恒溫培養箱、HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；M367983聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司；YIQI-125凝膠成像系統：德國VILBER公司；7890A-5975B氣相色譜-質譜儀：美國安捷倫公司；α1860紫外分光光度計：上海普元儀器有限公司；AW200SG厭氧工作站：金壇市科技分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥中酯化菌的富集方法

稱取5 g窖泥裝入含有45 mL無菌水的螺口瓶中，90 ℃恒溫水浴處理30 min，冷卻后于厭氧工作站按5%（V/V）的接種量接入富集培養基中，34 ℃條件下培養。

1.3.2 窖泥中酯化菌富集條件的確定

富集時間：樣品同1.3.1處理后，分別于34 ℃培養箱中培養0 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d，每組試驗3組平行。

富集次數：樣品同1.3.1處理后，在最佳富集時間下對富集液連續富集4次。

通過HS-SPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質含量及種類確定最佳富集時間和次數。

1.3.3 窖泥中酯化菌的分離純化

將富集液于90 ℃恒溫水浴處理30 min后，吸取1 mL富集液，按10倍梯度稀釋至10-5，選取稀釋梯度為10-2～10-5的菌液0.1 mL分別涂布至篩選培養基（已在厭氧工作站中靜置24 h），34 ℃條件下培養2～10 d（期間觀測菌落變化），挑選有透明圈的菌落進行分離、純化。將純化后的單菌株接種于富集培養基中（加入2%（V/V）乙醇），34 ℃培養15 d，通過GC-MS檢測發酵產物中有無己酸乙酯或丁酸乙酯。

1.3.4 窖泥中酯化菌培養條件研究

種子液制備：于厭氧工作站中將目的菌株分別接種于液體篩選培養基中，34 ℃條件下嚴格厭氧培養48 h。

生長曲線：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養基，34 ℃條件下嚴格厭氧培養，每8 h取出8 mL培養液，采用紫外分光光度計在波長660 nm處測定吸光度值（OD660nm值）。

生長溫度：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養基，分別置于20 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃和60 ℃條件下嚴格厭氧培養48 h。

生長pH值：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于不同pH值（2～10）的液體篩選培養基，34 ℃條件下嚴格厭氧培養48 h。

乙醇耐受性：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于乙醇體積分數不同（2%～23%）的液體篩選培養基，34 ℃條件下嚴格厭氧培養48 h。

以上試驗分別取8 mL發酵液，測定OD660nm值，且均以未接種的培養基為空白對照。

1.3.5 窖泥中酯化菌的鑒定

形態觀察及生理生化試驗：根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]和《常見細菌系統鑒定手冊》[13]對篩選的目的菌株選擇性地進行形態觀察和生理生化鑒定[14-15]。

分子生物學鑒定：提取目的菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用細菌通用引物27F、1492r對目的菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增[16-17]，PCR擴增產物委托上海美吉公司進行測序。將測序結果提交至美國國家生物信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.6 酯類物質的檢測

取5 mL富集液或發酵液于頂空瓶中，再加入2 g NaCl和0.25 mL乙酸正丁酯（0.2 mg/mL）作為內標，混勻，置于55 ℃固相微萃取儀中平衡15 min后，插入萃取針頭萃取30 min，參照文獻[18]進行GC-MS檢測。質譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標準譜庫進行比對，利用匹配度均＞800的特征離子進行定性分析；采用內標法進行半定量。

1.3.7 數據分析

結果以“平均值±標準偏差”表示。利用SPSS19.0軟件進行方差分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 窖泥中酯化菌富集方法的優化

窖泥經不同富集時間、不同富集次數富集后，采用HSSPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質含量和種類數的變化，結果見圖1。

圖1 富集時間（a）及富集次數（b）對富集液中酯類化合物含量和種類數的影響Fig.1 Effect of enrichment time (a) and number of enrichment (b) on the content and type of ester compounds in esterified liquid

由圖1a可知，隨著富集時間的延長，窖泥富集液中酯類物質種類數和含量均呈先增加后穩定的變化趨勢。富集16 d時，窖泥富集液中酯類物質種類數達到11種，酯類物質總含量達到199 mg/100 mL，均顯著高于富集前期（P＜0.05）。富集16 d后，隨著富集時間的延長，窖泥富集液中酯類物質種類數和含量均趨于穩定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于富集16 d后目標菌群進入穩定期，隨著營養物質消耗及富集液中微生物代謝產物的積累，目標菌群生長受到抑制逐漸進入衰亡期。

由圖1b可知，隨著富集次數的增加，窖泥富集液中酯類物質含量呈先上升后降低的變化趨勢，富集2次時，酯類化合物含量達到最大（280 mg/100 mL），顯著高于1次富集（P＜0.05）；而酯類物質種類數隨富集次數增加呈下降變化，富集2次時酯類物質種類數為8種，隨后趨于穩定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于第一次富集液中產酯微生物種類豐富但生物量較少，導致其代謝產物酯類物質種類數多而含量較少，隨著富集次數增加，富集液中微生物逐漸被馴化，部分微生物被淘汰，優勢產酯微生物愈加的集中，使得富集液中的酯類物質種類數趨于穩定而含量升高[19]。因此，窖泥富集液富集培養16 d，富集2次有利于酯化菌的富集。但為保證目標微生物的富集效果，略微延長富集時間，選擇富集時間為20 d。

2.2 窖泥中酯化菌的分離與篩選

采用稀釋平板涂布法從優化后的窖泥富集液中分離出23株菌，再通過HS-SPME-GC-MS檢測復篩出3株代謝生產己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3。

2.3 酯化菌的鑒定

2.3.1 形態觀察

3株菌株的菌落、細胞形態及其革蘭氏染色結果見圖2。

圖2 3株菌株的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of 3 strains

由圖2可知，3株菌皆為厭氧的革蘭氏陽性（G+）白色桿狀細菌。菌株Y1的菌落呈米白色、正反面顏色一致、邊緣規整、圓形、外觀形態小，細胞呈桿狀、有一定的排列方式，革蘭氏陽性，厭氧；菌株Y2的菌落呈灰白色、菌落中間顏色較淺、邊緣顏色較白、較光滑、比較濕潤、不易于挑取，細胞呈桿狀，G+，厭氧；菌株Y3的菌落呈黃白色、濕潤、光滑、不透明、外觀形態小、易于挑取，細胞呈桿狀，G+，厭氧。

2.3.2 生理生化鑒定結果

3株菌株的生理生化試驗結果見表1。

表1 3株菌株的生理生化鑒定結果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of 3 strains

由表1可知，菌株Y2水解淀粉結果為陰性，菌株Y3的接觸酶試驗結果呈陰性，除此之外，3株菌株的其他生理生化反應試驗結果均呈陽性。結合形態觀察，初步鑒定菌株Y1、Y2、Y3均為厭氧梭菌屬（Clostridiumsp.）。

2.3.3 分子生物學鑒定結果

菌株Y1～Y3純化后提取基因組DNA，以其為模板進行16S rDNA的擴增，采用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，結果見圖3。

圖3 3株菌株16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Results of agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR product of 3 strains

由圖3可知，3株菌株的16S rDNA PCR擴增產物的堿基長度為1 600 bp左右，與預期結果相符，委托上海美吉公司進行測序。將測序結果提交至NCBI的GenBank數據庫中進行Blast比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖4。

圖4 基于16S rDNA基因序列3株菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 3 strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株Y1與拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）聚于一支，親緣關系最近；菌株Y2與Clostridium guangxiense聚于一支，親緣關系最近；菌株Y3與Clostridium sartagoforme聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察及生理生化試驗結果，鑒定菌株Y1、Y2、Y3分別為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、Clostridium guangxiense、Clostridium sartagoforme。有文獻報道，C.beijerinckii、C.guangxiense能發酵產丁醇，特別是C.beijerinckii能夠利用糖質和木質素水解液發酵產丁醇，在用生物法來生產丁醇中得到廣泛應用[20-21]；C.sartagoforme是一種纖維素（和幾丁質）降解細菌[22]。

3株酯化菌均為厭氧梭菌，這可能是由于梭菌在優質窖泥中已經是優勢微生物[23-26]，經過富集培養基多輪次富集，在富集液中占據主導地位，這也表明窖泥中的梭菌可能為濃香型白酒釀造中重要的酯化生香菌。因此，加強這3株菌的研究對提升白酒質量具有重要意義。

2.4 酯化菌培養條件試驗結果

2.4.1 3株菌株的生長曲線

為了解菌株Y1、Y2、Y3的生長情況，在厭氧條件下測定3株菌株的生長曲線，結果見圖5。

圖5 3株菌株厭氧條件下的生長曲線Fig.5 Growth curve of 3 strains in the anaerobic condition

由圖5可知，3株菌株的生長趨勢一致，生物量均呈先上升后穩定再下降的變化趨勢，其中前24 h為延滯期；24～64 h為對數生長期；64～80 h為平穩期；80 h后進入衰亡期。這可能是由于前24 h菌株正在適應新的培養液環境，大量合成細胞分裂所需的酶類及其他細胞成分，細胞生長但不分裂，培養液中生物量不變；24 h后菌株已適應新的生長環境，豐富的營養物質使它們快速生長繁殖；64 h后培養液中的大部分營養物質被消耗以及代謝產物的累積，使得部分微生物消亡，此時微生物的增長和消亡趨于穩定，3株菌株生物量保持穩定；80 h后培養液中可利用營養物質完全被利用，微生物逐漸消亡。

2.4.2 3株菌株最適生長溫度、pH及耐乙醇能力試驗

通過紫外分光光度計檢測菌株Y1～Y3經不同溫度、不同pH值及不同體積分數乙醇培養后的OD660nm值，結果見圖6。

圖6 溫度（a）及pH值（b）對3株菌株生長的影響及其耐乙醇能力（c）Fig.6 Effect of temperature (a) and pH (b) on 3 strains growth and its ethanol tolerance (c)

由圖6可知，隨著培養溫度、pH值的升高，3株菌株的生物量均呈先增加后降低的趨勢，且3株菌株均在溫度為30～41 ℃、pH值為5～10、乙醇體積分數為2%～8%的范圍內生長良好。其中，菌株Y1的最佳生長溫度為30 ℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34 ℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分數為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數為20%。

3株菌株均能在窖池環境中良好生長，這與篩選環境有關。菌株Y1～Y3來自濃香型窖池底部的優級窖泥，長期處于釀酒環境使得3株菌不斷被馴化，具有較高的耐乙醇能力[27]。此外，這3株菌的最佳生長溫度在30～37 ℃，這可能表明它們主要生長在濃香型白酒的發酵的高溫期，窖池內糟醅發酵溫度分為“前緩、中挺、后緩落”三個階段，其中中挺階段發酵溫度一般在30 ℃以上[28]。

3 結論

本試驗對窖泥酯化菌的富集方法進行優化，發現富集液培養20 d、連續富集2次，富集液中酯化菌的富集效果最好。采用傳統分離方法從優化富集液中分離、篩選得到3株產己酸乙酯和丁酸乙酯較強的酯化菌，經形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定菌株Y1為Clostridium beijerinckii、Y2為Clostridium guangxiense、Y3為Clostridium sartagoforme。通過對3株菌株的生長特性研究發現，菌株Y1的最佳生長溫度為30 ℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34 ℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分數為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分數為20%。3株菌株均能在濃香型白酒窖內進行很好的生長繁殖，加強這3株菌株的研究對提升濃香型白酒糟醅質量具有重要作用。