南寧地區(qū)米酒曲源乳酸菌在糯米汁中氨基酸和有機(jī)酸代謝特征研究

葛東穎，何夢(mèng)雪，張振東，鐘小丹，顏 娜，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北 孝感 432003）

作為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要組成部分，米酒[1]、黃酒[2]、白酒[3]、饅頭[4]、酸粥[5]和鲊廣椒[6]等均是以谷物為基礎(chǔ)原料，通過自然環(huán)境、接入的酒曲或酸面團(tuán)中的微生物菌株發(fā)酵而成。酸粥[5]和鲊廣椒[6]等谷物發(fā)酵食品以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，越來越多的研究亦表明，乳酸菌對(duì)其品質(zhì)形成具有較大的影響[7]。顧旭峰等[8]研究指出，乳酸菌亦具有一定的淀粉水解能力，其發(fā)酵后的谷物制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)均有進(jìn)一步提升。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆肽溶液因有機(jī)酸含量顯著增加而使得苦腥味減弱[9]，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的燕麥全谷物中燕麥蛋白和必需氨基酸具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]，乳酸菌協(xié)同發(fā)酵可進(jìn)一步提升餅干的風(fēng)味[11]。篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌菌株用于谷物食品的生產(chǎn)一直都是研究的熱點(diǎn)，陳妍婕等[12-13]分別篩選出了適合糙米乳、酸漿水和發(fā)酵糯玉米黏豆包生產(chǎn)的乳酸菌菌株，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)米酒曲中亦蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌菌株資源[15]。有研究表明[16-17]，氨基酸和有機(jī)酸在賦予產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，亦可改善產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)，因而在菌株的篩選過程中氨基酸和有機(jī)酸備受關(guān)注。

本研究采用純培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)廣西省南寧地區(qū)米酒曲中乳酸菌多樣性進(jìn)行解析，在獲取乳酸菌菌株并明確其分類地位的基礎(chǔ)上，探討乳酸菌純種發(fā)酵糯米汁的可行性，并揭示乳酸菌在糯米汁中產(chǎn)氨基酸和有機(jī)酸的代謝特征，以期為后續(xù)篩選用于谷物發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

米酒曲：購(gòu)于南寧市五里亭農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、瑯西菜市場(chǎng)、淡村菜市場(chǎng)和北湖農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，共采集11 個(gè)樣品，所有酒曲均為南寧本地制作和銷售；糯米和白糖：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

耐高溫α-淀粉酶（3萬(wàn)U/g）、糖化酶（5萬(wàn)U/g）、瓊脂粉、羧甲基纖維素鈉（均為生化試劑）：湖南鴻鷹祥生物工程有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumammonium bromide，CTAB）、丙三醇、氯化鈉、乙酸鈉、酚、氯仿和異戊醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Axygen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；10×PCR buffer、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、rTaq酶、Solution I、pMD18-T vector和10×Loadingbuffer：寶生物工程（大連）有限公司；DL 15000 Marker和DL2000Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物27F/1495R和M13F（-47）/M13R（-48）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99.99%）：西隴科學(xué)股份有限公司；氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)品（各氨基酸濃度均為2.5 μmol/mL，純度均≥99.5%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氨基酸分析儀緩沖液1、緩沖液2、緩沖液5和緩沖液6：英國(guó)Biochrom公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站：英國(guó)Don Whitley公司；PTC-100 PCR儀：美國(guó)ABI公司；Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；LC-2K004樂創(chuàng)雙門蒸飯車：韓泰電器有限公司；XP07亞力西全自動(dòng)打漿機(jī)：深圳市喜來家具電器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LC-20ADXR高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；Biochrom 30+全自動(dòng)氨基酸分析儀：英國(guó)Biochrom公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離、純化及保藏

將米酒曲研磨后使用生理鹽水倍比稀釋后涂布于添加1.0%CaCO3的固體MRS培養(yǎng)基，倒置于30 ℃厭氧工作站中（厭氧條件為85%N2、10%H2及5%CO2）培養(yǎng)2 d。隨后選取菌落數(shù)在30～300的平皿，挑取形態(tài)、大小和顏色各不相同且均具有透明圈的單菌落[18]，采用平板三區(qū)劃線法劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧培養(yǎng)2 d。連續(xù)劃線3次后，挑取單菌落培養(yǎng)于5 mL MRS液體試管中于生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)1 d，離心收集菌體后添加30%的甘油凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

采用CTAB法提取分離得到的疑似乳酸菌的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[19]，并以提取出的DNA為模板，使用27F/1495R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系[20]：10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL、引物各0.5 μL、rTaq酶0.2 μL、DNA模板0.5 μL和超純水18.8 μL。擴(kuò)增程序[21]：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s，共循環(huán)30 次；最后72 ℃再延伸10 min。對(duì)電泳結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物使用清潔試劑盒清潔，將清潔產(chǎn)物連接至pMD18-T載體再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，最后將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子寄往武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將返回的序列于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）比對(duì)分析，進(jìn)而明確其種屬分類地位。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵糯米汁的制作

糯米淘洗后蒸熟，加入干米質(zhì)量6 倍的純水?dāng)嚢杈鶆颍?0 ℃水浴30 min后放入破壁機(jī)中破碎約5 min至糊狀，并添加0.5%的耐高溫α-淀粉酶加熱至90 ℃保溫1 h后，降溫至60 ℃添加0.3%的糖化酶保溫1 h，使用8 層紗布過濾后濾液添加瓊脂粉、白砂糖和羧甲基纖維素鈉，其與濾液質(zhì)量比分別為0.04%、5.00%和0.15%，分裝與500 mL三角瓶中115 ℃15 min滅菌，冷卻至室溫后按照107CFU/mL糯米汁接入乳酸菌，30 ℃發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后8 000 r/min離心10 min，取濾液備用。

1.3.4 乳酸菌純種發(fā)酵糯米汁氨基酸含量的測(cè)定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法對(duì)發(fā)酵糯米汁進(jìn)行預(yù)處理。使用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，對(duì)發(fā)酵糯米汁中氨基酸含量進(jìn)行定量分析。檢測(cè)條件：色譜柱為磺酸型陽(yáng)離子樹脂、檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm和570nm，溫度梯度為38℃、50℃和93℃，流速為35 mL/h，緩沖液1、緩沖液2、緩沖液5和緩沖液6分別洗脫9 min、12 min、20 min和6 min。

1.3.5 乳酸菌純種發(fā)酵糯米汁有機(jī)酸含量的測(cè)定

將糯米汁兩倍稀釋于0.01 mol/L磷酸二氫鉀流動(dòng)相中，靜置30 min后過0.22 μm濾膜，參照楊成聰?shù)萚22]的方法并做適當(dāng)修改對(duì)其有機(jī)酸的含量進(jìn)行絕對(duì)定量。測(cè)試條件：流動(dòng)相的pH值為2.7、流速為0.8 mL/min、色譜柱型號(hào)為Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫為25 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm、進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)乳酸菌發(fā)酵糯米汁的氨基酸與有機(jī)酸的代謝特征進(jìn)行分析；使用BioEdit和MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米酒曲中乳酸菌的分離鑒定

通過純培養(yǎng)方式，并以菌落形態(tài)為判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究共從11個(gè)米酒曲樣品中分離到20 株過氧化氫為陰性的疑似乳酸菌菌株，記為HBUAS53361～HBUAS53364、HBUAS53366～HBUAS53370、HBUAS53373～HBUAS53377、HBUAS53379～HBUAS53380和HBUAS53431～HBUAS53434（HBUAS為湖北文理學(xué)院英文名稱首字母縮寫），部分分離株的菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 部分疑似乳酸菌分離株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of some suspected lactic acid bacteria isolates

由圖1可知，在含有1.0%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基中，菌落均形成了透明圈，究其原因可能在于菌株產(chǎn)生的乳酸與碳酸鈣發(fā)生了反應(yīng)，同時(shí)由于不同菌株產(chǎn)酸能力存在差異，培養(yǎng)基呈現(xiàn)出的透明程度亦不同。此外，菌落均呈現(xiàn)出中央凸起且周圍較規(guī)則的圓形、外表濕潤(rùn)、有光澤、大小約在2～3 mm、顏色為白色或米黃色，這些均符合乳酸菌的菌落形態(tài)特征[23]，故而將所有菌株初步判定為乳酸菌菌株。在對(duì)分離株DNA進(jìn)行提取和16S rRNA序列全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，電泳圖如圖2所示。

由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度約在1 500 bp左右，符合乳酸菌16S rRNA序列全長(zhǎng)的特征，同時(shí)各條帶清晰且無明顯拖尾現(xiàn)象，說明PCR產(chǎn)物濃度和質(zhì)量均較高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。在對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔、連接、轉(zhuǎn)化、挑選陽(yáng)性克隆子測(cè)序后，將拼接好的序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取相似度≥99%的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA序列乳酸菌分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，20 個(gè)分離株被鑒定為5 個(gè)屬的7 個(gè)種，其中HBUAS53362等7 株菌被鑒定為片球菌屬（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus），HBUAS53364被鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）的植物乳桿菌（L.plantarum）；HBUAS53380被鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）的戊糖乳桿菌（L.pento sus）；菌株HBUAS53368和HBUAS53376被鑒定為乳球菌屬（Lactococcus）的臺(tái)灣乳球菌（L.taiwanensis）；菌株HBUAS53361被鑒定為魏斯氏菌屬（Weissella）的類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）；HBUAS53363等4 株菌被鑒定為魏斯氏菌屬（Weissella）的融合魏斯氏菌（W.confuse）；HBUAS53366等4 株菌被鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）中的屎腸球菌（E.faecium）。由圖3亦可知，P.pentosaceus占分離株的35%、W.confusa和E.faecium均占分離株的20%、L.taiwanensis占分離株的10%、其余3 種乳酸菌均占分離株的15%。由此可見，P.pentosaceus為米酒曲中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

在明確分離株種屬地位的基礎(chǔ)上，本研究使用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶對(duì)糯米進(jìn)行酶解后接種各分離株純種發(fā)酵，通過解析糯米發(fā)酵汁中氨基酸和有機(jī)酸代謝的特征，從而對(duì)各乳酸菌分離株的發(fā)酵特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。雖然E.faecium可用于食品加工[24]，但近年來越來越多的研究表明其可能存在一定的安全隱患[25]，故而本研究?jī)H評(píng)價(jià)了除E.faecium外其余16 株乳酸菌的發(fā)酵特性。

2.2 發(fā)酵糯米汁中氨基酸種類與含量的分析

采用氨基酸分析儀對(duì)糯米汁中氨基酸的種類與含量進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵糯米汁中氨基酸種類與含量分析結(jié)果Table 1 Results of the kinds and contents of amino acid in glutinous rice juice mg/L

由表1可知，在發(fā)酵糯米汁中僅檢測(cè)出6 種氨基酸，分別為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸和亮氨酸，而在未發(fā)酵糯米汁中共檢測(cè)出10種氨基酸，除上述6 種氨基酸外，還檢測(cè)出了苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和蘇氨酸。由表1亦可知，作為一種用糯米發(fā)酵釀制而成的甜黃酒，江蘇丹陽(yáng)封缸酒的氨基酸含量遠(yuǎn)高于本研究中各分離株制備的發(fā)酵糯米汁[26]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能在于，黃酒的發(fā)酵是多菌種參與的過程，其中霉菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，而糯米汁的制作僅使用乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵，乳酸菌自身蛋白水解能力較差；黃酒制作時(shí)使用蒸熟后的糯米進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，而本研究將蒸熟后的糯米加水和蛋白酶酶解后進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，糯米汁中自身蛋白含量就明顯低于前者。此外，酶解后的糯米汁中部分氨基酸被乳酸菌生長(zhǎng)利用掉，可能是導(dǎo)致發(fā)酵糯米汁中氨基酸種類偏少的原因。

2.3 發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸種類與含量的分析

基于HPLC技術(shù)發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸種類與含量的分析，以有機(jī)酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。

由表2可知，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，表明7 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程均有較高的可信度。未發(fā)酵糯米汁中僅檢出5種有機(jī)酸，有機(jī)酸總量為793.75 mg/L，乳酸菌發(fā)酵糯米汁中共檢出7種有機(jī)酸，有機(jī)酸總量的范圍在1 901.78～16 144.68 mg/L。由此可見，乳酸菌發(fā)酵可明顯提升糯米汁中有機(jī)酸的含量。蒸熟的糯米經(jīng)α-淀粉酶和糖化酶酶解后，淀粉部分水解為葡萄糖，為乳酸菌的發(fā)酵提供了碳源。由表2亦可知，乳酸的含量范圍在1 595.11～4 559.03 mg/L，為含量最多且變幅最大的有機(jī)酸，這說明不同分離株在糯米汁中的產(chǎn)酸能力不同，此外部分分離株發(fā)酵的糯米汁中并不存在酒石酸、蘋果酸和乙酸，這可能亦與菌株代謝特性有關(guān)。

表2 糯米汁中有機(jī)酸種類與含量分析結(jié)果Table 2 Results of the kinds and contents of organic acid in glutinous rice juice

2.4 發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸的主成分分析

采用PCA對(duì)乳酸菌發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸和氨基酸的代謝特征進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸與氨基酸的因子載荷圖見圖4。

由圖4可知，7種有機(jī)酸可分為2個(gè)主成分（principal component，PC），其中PC1由草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和琥珀酸等5個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，其方差貢獻(xiàn)率為74.41%；PC2由檸檬酸和乳酸2個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，其方差貢獻(xiàn)率為16.93%。由圖4亦可知，PC1中5 個(gè)指標(biāo)均在X軸正方向，PC2中2 個(gè)指標(biāo)均在Y軸正方向，故而在因子得分圖中位于第一象限的分離株產(chǎn)有機(jī)酸的能力相對(duì)較強(qiáng)，而位于第三象限的分離株呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。基于PC1和PC2的因子得分圖如圖5所示。

圖4 發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸與氨基酸的因子載荷圖Fig.4 Factor loading diagram of organic acids and amino acids in fermented glutinous rice juice

圖5 發(fā)酵糯米汁中有機(jī)酸與氨基酸的因子得分圖Fig.5 Factor score diagram of organic acids and amino acids in fermented glutinous rice juice

由圖5可知，僅有W.confuseHBUAS53367位于第一象限，表明其在發(fā)酵糯米汁中產(chǎn)有機(jī)酸能力相對(duì)較強(qiáng)，而P.pentosaceusHBUAS53362、P.pentosaceusHBUAS53375、P.pentosaceusHBUAS53379、P.pentosaceusHBUAS53432、P.pentosaceusHBUAS53433、W.confuseHBUAS53370和L.taiwanensisHBUAS53368均位于第三象限，表明其產(chǎn)有機(jī)酸能力相對(duì)較弱。

3 結(jié)論

南寧地區(qū)米酒曲中乳酸菌具有較高的多樣性，且戊糖片球菌（P.pentosaceus）為其中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。使用除屎腸球菌外的乳酸菌分離株進(jìn)行發(fā)酵糯米汁制備，發(fā)現(xiàn)所有分離株均不產(chǎn)氨基酸，乳酸為發(fā)酵糯米汁中主要有機(jī)酸，其中融合魏斯氏菌（W.confuse）HBUAS53367產(chǎn)有機(jī)酸能力較強(qiáng)，可用于后續(xù)進(jìn)一步研究。