醬油中氨基甲酸乙酯形成機制、檢測技術及控制研究進展

葉月華，劉曉艷 *，白衛東，黃漢聰

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣東 廣州 510300）

醬油的歷史源遠流長，得益于其特有的色、香、味、體而備受歡迎，不僅可以增加消費者的食欲，而且具有較高的營養價值，因此成為我國傳統的發酵調味品之一。但美中不足的是，在醬油釀造過程中，會自發性地產生有毒有害的可能致癌物質即氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）。迄今，很多研究者在其他發酵食品和酒精飲料也檢測到EC的存在。據報道[1]，醬油中EC的含量范圍是＜檢出限（limit of detection，LOD）～43.93 ng/g，而酒類中EC的含量范圍是＜LOD～239.40 ng/g。盡管醬油中EC的含量相對于酒精飲料中EC的含量較低，但醬油在人們的日常飲食當中占據不可或缺的地位，毫無疑問日積月累的攝入量仍然會給人體的健康帶來一定隱患，很可能成為EC的主要危害來源[2]。聯合國糧農組織規定EC含量≤20 μg/L[3]；1985年，加拿大對各類酒中的EC限量標準作出規定：白蘭地和烈性酒不能超過0.4 mg/L，強化葡萄酒和日本清酒不能超過0.10 mg/L，蒸餾酒不能超過0.15 mg/L，佐餐葡萄酒不能超過0.03 mg/L；1988年，美國也限定了葡萄酒中EC的含量：佐餐葡萄酒不得超過0.015 mg/L，餐后葡萄酒不得超過0.06 mg/L[4]；然而我國尚未對發酵制品中EC制定限量標準。“民以食為天，食以安為先”。隨著人們對食品安全重視程度的提高，作為醬油生產大國應盡快解決醬油中EC的形成機理及減除的問題。因此，很有必要探究如何抑制醬油生產過程中產生的有害物質，有利于保障我國傳統發酵食品的安全性和維護其國際形象[5]。本文針對醬油中EC的危害、形成機制、檢測技術及調控措施等方面進行綜述，以期為醬油中EC的控制，提高醬油的安全性提供參考。

1 氨基甲酸乙酯的概況

氨基甲酸乙酯又稱為烏拉坦（urethane），易溶于水、乙醇和乙醚，分子式為C3H7NO2，分子質量為89.09。早年EC的用途相當廣泛，是制造香料、醫藥等的中間材料及用于生物化學研究。20世紀40年代初，EC是主要的麻醉藥；1943年，NETTLESHIP首次發現了EC的致癌性，只是當時EC在食品中的含量并未足夠引起人們的重視[6]；1974年，國際癌癥研究機構確定EC為2B類致癌物質，直到2007年，再次將EC從2B類致癌物質列入2A類致癌物質[7]。自此，學者們深入剖析了EC的致癌機理，發現EC屬于多位點致癌物，可以通過多種途徑進入人體內，其中大概5%的EC無須代謝以排泄物的形式直接排出體外；而90%以上的EC在肝臟細胞的微粒酯酶水解作用下產生乙醇、氨和碳水化合物并被代謝掉；還有0.1%左右的EC通過線粒體中的細胞色素P450作用下氧化成N-羥基-氨基甲酸乙酯，N-羥基-氨基甲酸乙酯會誘發部分器官中的酯酶產生O2-及NO，Cu2+可以催化NO和O2-產生過氧化氮，最終形成8-羥基-脫氧鳥苷，隨后會導致脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）發生堿基顛換，由此誘發癌變[8]。此外約0.5%的EC被細胞色素P450氧化成乙烯基氨基甲酸乙酯，后轉化成的乙烯基氨基甲酸酯環氧化物能夠與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）等結合誘發堿基對置換從而造成DNA損壞。目前國內研究EC的對象主要是酒類，而其他釀造食品如醬油中EC的研究相對較少，這是一項亟待解決的工作[9]。

2 醬油中氨基甲酸乙酯的形成機制

已有文獻報道，EC的形成與其前體物質的種類和含量有關，而前體物又和發酵微生物本身性質密切相關（如釀酒酵母可以代謝精氨酸為尿素，而醬油中的乳酸桿菌可以代謝精氨酸為瓜氨酸）[10]。由于發酵制品中的EC主要是由乙醇和尿素、瓜氨酸等前體物質自發反應產生的，因此酒中大量的乙醇為EC的形成提供了更好的環境，所以其EC的平均含量（35.74 ng/g）比醬油中EC的平均含量（23.45 ng/g）高，如表1所示[1]。但兩者中EC的具體形成機制是否一樣還需進一步研究。

表1 市售酒類和醬油中的氨基甲酸乙酯含量檢測結果Table 1 Determination results of ethyl carbamate contents in commercial alcoholic beverage and soy sauce

在高鹽稀態醬油發酵過程中，釀造原料會被微生物分解成小分子物質，有一部分會進入常見酵母菌（如魯氏接合酵母、畢赤酵母等）后經糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）和鳥氨酸循環（ornithine cycle）這兩種途徑生成的尿素和乙醇被釋放到細胞外；另一部分則經胞內精氨酸脫亞氨酶途徑被嗜酸乳酸足球菌利用，從而代謝精氨酸生成瓜氨酸和氨甲酰磷酸被釋放到細胞外，這兩種重要的中間物質在整個發酵環境體系中聚合后，由特定的酶的催化下從而形成EC。

MATUSUDO T等[11]曾認為醬油中EC的主要前體物質是瓜氨酸，這是分別通過研究日式醬油和國內醬油分析前體物的添加與EC生成量的關系得出的重要結論。乳酸發酵時期和乙醇發酵時期都能積累瓜氨酸，但實驗發現瓜氨酸的主要積累時期是乳酸發酵期。瓜氨酸在乳酸發酵期主要是通過嗜酸乳酸足球菌代謝精氨酸產生的，在醬油的高鹽條件下，嗜酸乳酸足球菌在精氨酸脫亞氨酶途徑中分別負責編碼精氨酸脫亞胺酶和鳥氨酸轉氨甲酰酶的兩個關鍵基因arcA和arcB的表達量縮減，造成瓜氨酸的生成速率大于其降解速率，從而導致瓜氨酸的積累；瓜氨酸在乙醇發酵期的積累則是因為游離脂肪酸的存在促使更多的精氨酸轉化成瓜氨酸。此外，pH和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等環境因素也會影響精氨酸脫亞氨酶途徑中編碼精氨酸脫亞氨基酶（arginine desiminase，AD）arc A；編碼鳥氨酸氨甲酰基轉移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）arc B；編碼氨甲酰磷酸激酶（carbamyl phosphate kinase，CPK）arc C這3種關鍵基因的表達，進而對醬油中瓜氨酸的積累產生影響。

由于醬油樣品易受生產原料、發酵方式、工藝、產地等因素的限制，因此不同地區和不同釀造工藝的醬油中EC含量會大相徑庭（見表2）[13]。通常情況下，添加入酵母的醬油EC含量高于傳統工藝醬油的，原因是外源性加入的酵母菌會通過代謝精氨酸產生尿素，致使EC含量也會隨之增加。

表2 不同地域和各類生產工藝醬油中的氨基甲酸乙酯含量Table 2 Ethyl carbamate contents in soy sauce in different regions and various production processes

3 醬油中氨基甲酸乙酯的檢測方法

由于EC濃度低、在定量測定時還會受到不同基質不同程度的干擾，因此需要特別靈敏的方法[14]。當前國內外專家學者始終致力于對檢測醬油中EC的研究方法進行不斷的優化。目前，已有報道的針對醬油中EC的檢測方法[15]主要有氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術、氣相色譜-串聯質譜（gas chromatographytandem massspectrometry，GC-MS/MS）技術、高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術、高效液相色譜-熒光檢測器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）技術和熒光光度（fluorophotometry）法等。

3.1 氣相色譜-質譜聯用技術

氣相色譜-質譜聯用是多數文獻所提及到的用于檢測食品中EC含量的方法，其結合了色譜法的高分離效能與質譜法的高鑒別能力，對EC達到同時定量、定性的檢測目的。以下是研究者將醬油樣品采用不同的前處理方法，包括液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）、固液萃取（solid liquid extraction，SLE）、分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）、頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME），結合GC-MS對測定結果等方面進行分析比較，以此驗證方法的可行性與可靠性。

3.1.1 固相萃取結合氣相色譜-質譜聯用法

呂昱等[16]建立一種使用選擇離子掃描（selective ion monitoring，SIM）模式以及外標法的固相萃取結合GC-MS方法來檢測貴州當地的市售醬油，其中醬油需在萃取小柱中停留30 min，而后選擇1∶9（V/V）的丙酮-二氯甲烷來洗脫EC，由于EC易溶于C18萃取柱中，所以固相萃取（SPE）比液液萃取（LLE）更能有效分離提取醬油中的EC。結果顯示，EC的含量為340～440 μg/mL，在1～10 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，檢測限為0.014 μg/mL，定量限（S/N=10）為0.048 μg/mL，加標回收率達97.78%，加標回收率結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.59%；其特點在于較高的靈敏度、良好的精密度以及較廣的線性范圍等，能夠達到定性定量的目的。

3.1.2 固液萃取結合氣相色譜-質譜聯用法

肖泳[17]分別采用液液萃取（LLE）和固液萃取（SLE）對醬油中EC進行前處理，其中LLE使用乙酸乙酯進行洗脫，而SLE的層析柱使用可吸附顏色的活性炭-硅膠和無水硫酸鈉作填充，并在條件優化中發現選擇40 mL甲醇∶二氯甲烷（1∶9，V/V）使EC回收率達到90.34%～98.96%，日內精密度RSD為2.61%～4.67%，日間精密度RSD為3.53%～6.05%，結合GC-MS檢測出EC在20～1 500 μg/L質量濃度范圍內有著良好的線性關系，檢測限（S/N＞3）為4 μg/L；然而LLE法的日內精密度RSD為4.14%～5.27%，日間精密度RSD為4.53%～7.22%，不僅回收率最低達不到70%，還存在大量色素和造成離子源污染。綜上研究發現，SLE法相比于LLE法具有更高的精準度、更好的重現性且有機溶劑耗費少，尤為凸顯其環保性。因此，SLE結合GC-MS法檢測醬油中EC更具優勢。

3.1.3 分散固相萃取結合氣相色譜-質譜聯用法

目前測定醬油中EC的GC-MS 法大多采用以硅藻土為填料的SPE進行凈化處理，有學者發現DSPE比SPE法更快速、簡便、穩定且無需較大的溶劑體積[18]。章晴等[19]對飲料酒中的EC用GC-MS測定時，其分散固相萃取的凈化方法使用了N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA），后發現它對醬油中的氨基酸、有機酸和色素等大量干擾成分有很不錯的消除能力。對此，陳達煒等[20]對醬油樣品液液萃取時選擇的是乙腈，DSPE凈化用N-丙基乙二胺（PSA），采用氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定醬油中的EC。學者優化實驗條件（選擇離子檢測模式和選取100 mg PSA粉）后發現EC在10～500 μg/L質量濃度范圍內有著較好的線性相關關系，方法的檢出限為2.0 μg/kg，此法簡單且準確，具有很好的實際推廣價值。

3.1.4 頂空-固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用法

豐帆[21]考慮到固相萃取法對樣品前處理的復雜性和耗時性，在此基礎上建立了頂空固相微萃取技術，用以處理不同種類醬油樣品，可有效縮短時間且不需要萃取溶劑，簡單方便，易穩定；分別優化了萃取纖維頭、pH值、萃取時間、萃取溫度等條件，同一樣品經GC-MS檢測所得結果與美國分析化學家協會（association of official analytical chemists，AOAC）官方檢測結果比對相差無幾（相關系數R2＞0.95），檢出限（S/N=3）為1.0 μg/L，EC回收率達70.56%～129.21%，足以證明該方法的可行性與準確性。此外，還有待研究合成特異性吸附的纖維頭涂層，可進一步提高和完善氨基甲酸乙酯的檢測靈敏度和有效性。

張燕等[22]對萃取纖維涂層等分析條件的優化也建立了一種HS-SPME-GC/MS方法，頂空萃取是將纖維暴露于樣品，頂空吸附不同pH值的樣品，結果發現，醬油中EC的回收率達到了70.56%～129.21%，檢出限為1.0 μg/L，日內精密度RSD為3.69%，日間精密度RSD為8.50%；研究表明該方法具有一定的準確性和穩定性，不足的是定量檢測的精確度不高，檢測范圍較窄，檢測周期較長。

3.2 串聯質譜技術

3.2.1 氣相色譜-串聯質譜技術

GC-MS法因其靈敏度較高被視為測定酒中EC最為普遍的方法[21]，但醬油基體復雜會嚴重干擾GC-MS中絕大多數特征離子，其定性確證能力因此受到很大局限。徐小民等[23]利用有機硅藻土填充的固相萃取法提取醬油中的EC，所采用的同位素內標法比外標法大大減少將近7倍的有機溶劑用量，EC的回收率達96.2%～104.0%；后經比較多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式與選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）模式的實驗結果發現，MRM模式對EC定性定量的準確性較高，檢測限為2 μg/kg，還能避免SIM模式出現的基體干擾和假陽性現象。

3.2.2 高效液相色譜-串聯質譜技術

PARK S K等[24]以韓國醬油作為研究對象，建立了使用高效液相色譜串聯質譜（highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS）技術測定其EC含量的方法，EC的質量濃度在10～100 μg/L和0.1～20 μg/L范圍內變化時，該方法均呈現良好的線性關系，檢測限為0.25 μg/L；缺點是儀器設備昂貴，樣品制備繁瑣，測定周期較長。

綜上可知，串聯質譜方法要優于單級質譜法，但目前遠不足以滿足市場量大面廣的需求。

3.3 高效液相色譜-熒光檢測器技術

該方法適用于檢測酒類飲料中的EC含量，樣品預處理簡便，設備要求簡單是優點所在，但檢測限卻僅達20 μg/L左右[25]。由于醬油等發酵食品EC濃度水平較低，因此并不建議使用該方法測定。不過，陳可[26]通過利用乙酸乙酯萃取醬油中的EC，優化樣品的衍生化反應條件以及高效液相色譜熒光檢測器（high performance liquid chromatographyfluorescence detector，HPLC-FLD）法的色譜條件，使其檢測限降低至5 μg/L，相關系數（R2）為0.988，平均回收率達到100.12%，能基本滿足醬油中EC的檢測需求。同時還利用該方法對不同種類的醬油進行了分析比較，結果發現EC含量與釀造工藝和地域存在很大的關聯性，如低鹽固態法和南方醬油中EC含量要高于高鹽稀態法和北方醬油；對于不同功能型醬油EC含量相差無幾，濃口醬油和老抽中EC含量比淡口醬油和生抽低約10%。魏華[27]分別采用紫外分光光度法、熒光光度法對醬油中的EC進行有效測定，結果經比較發現，熒光光度法對醬油中EC的最低檢測限值為0.01 mg/L，低于紫外分光光度法的0.04 mg/L，表明熒光光度法檢出效果更佳。黃秋婷等[28]針對醬油類樣品的特點，采用優化的QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）前處理方案，更具針對性的開發了四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜的EC檢測手段，在1～20 μg/L范圍內相關性良好，檢出限為1.5 μg/kg，具有較佳的精準度和靈敏度。

綜上研究發現，從線性范圍、檢出限、回收率和精密度等方面對比分析后發現GC-MS法比HPLC-FLD法精準度更高、重現性更好以及檢出限要低一些，顯然GC-MS法會更為成熟。而HPLC-MS/MS法的準確度、重復性、靈敏度等特性也要比GC-MS更勝一籌，但美中不足的是它和氣相色譜串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法一樣面臨儀器價格不菲和維護成本過高等問題，因此也難以推廣使用。經過諸多方法的比較，目前SPE結合GC-MS法相對會占優勢，在保證試劑用量少的同時還能批量操作，而且GC-MS法也是國際檢測EC含量的標準[29]，倘若研究學者能夠在此基礎上不斷優化實驗條件將會是今后較有發展前景方向的檢測方法。

4 醬油中氨基甲酸乙酯的控制

已有研究表明[30]，屬于混菌發酵的醬油在發酵過程中會存在微生物代謝某些含氮物質，進而產生多類前體物質參與EC的合成，導致醬油潛在的安全隱患。目前很多研究策略專注于減少這些前體物質。多種方法已被開發用于控制EC的合成，普遍使用的方法有物理、微生物、理化和酶法等技術。

4.1 物理法

引入活性炭過濾技術是用于減除醬油中EC有效且常見的方法，該方法可以去除約45%～47%的EC，但活性炭過濾會導致其口感下降[31]，其應用價值受到一定的限制。據報道，黃酒中EC 的直接減除與多種材料有關，如活性炭、硅膠、硅藻土、殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）等，其中用硅藻土吸附黃酒中的EC后能最大程度地保持酒體風味，故在黃酒中使用較多，且符合經濟效益。由于硅藻土產地不同，吸附性能差異很大，天然的硅藻土雜質含量也較高，會限制其在多方面的應用，需要通過提純改性等手段進一步提高其吸附性能。曹甜等[32-33]利用堿法改性硅藻土和殼聚糖改性硅藻土，探索其對黃酒中EC的吸附性能，結果發現經過堿處理后，硅藻土對黃酒中EC的減除率大大提升，且處理后酒體風味與原酒基本一致。可以嘗試將此法運用于減除醬油中的EC。

4.2 微生物干預法

張繼冉[13]嘗試從醬油乳酸發酵末期的醬醪樣品中篩選出控制EC前體物產生的解淀粉芽孢桿菌JY06，該芽孢桿菌在高濃度NaCl條件下利用精氨酸且不積累瓜氨酸。在小型模擬生產體系中添加該菌干擾微生物群落和消耗前體物質，可以達到降低EC積累的效果。由此可知，學者通過探尋一種關鍵微生物是對醬油發酵過程中EC前體形成有關聯性的，并理清了微生物代謝途徑與EC前體生成的關系，闡述了醬油中EC的生成途徑，在控制或減除醬油中EC含量這方面意義深刻，具有前瞻性。

張夢寒[34]以上述的解淀粉芽孢桿菌JY06 作為研究對象，通過高通量篩選手段對3種解淀粉芽孢桿菌JY06（分別采取紫外誘變、等離子誘變和定向馴化育種方法）進行改造，目的是提高菌株JY06 利用精氨酸的能力。學者將由此獲得的若干個可高效利用精氨酸的突變株添加入在醬油發酵前期的醬醪中，結果表明，其在發酵過程中對EC及其前體瓜氨酸的降解效果甚好，且證實了該菌株不會對醬油風味品質造成影響。

4.3 優化發酵工藝

王旭鋒[35]通過使用醬汁模擬體系替代完全醬醪發酵，使發酵在相對封閉環境中進行的同時，對醬油發酵中常見的原材料、常用酵母以及發酵溫度3種發酵工藝條件進行調控，跟隨發酵過程研究其中EC及其前體物的變化情況，找到可以在一定程度上減少EC合成的最佳工藝組合（18 ℃的低溫發酵與添加魯氏接合酵母S），從而為高鹽稀態醬油發酵生產控制提供理論依據。經調查，該方法的優勢在于安全性高和成本低。

4.4 酸性脲酶法

2015 年，KIM Y G等[36]以添加脲酶的韓國豆瓣醬為研究對象，在含有不同前體物（如乙醇、尿素和瓜氨酸）的發酵體系中加入此酶，結果顯示，發酵后的豆瓣醬中EC含量分別下降了17.3%、18.8%和38.4%。說明脲酶用于類似的發酵食品中EC的控制會產生異曲同工之妙。但是尚未有耐高滲脲酶能夠在高濃度NaCl的醬油發酵體系中完全適應的相關報道，對此還需要進一步深究。

4.5 氨基甲酸乙酯水解酶法

2006 年，日本首次從馬紅球菌（Rhodococcus equi）中獲得了EC水解酶的序列，但該酶是對一系列氨基甲酸乙酯類化合物都有效，并非只針對于EC水解，其對EC的目的性不強。因此，EC水解酶在食品中的使用效果還有待考究。在國內，李京京等[37]從小鼠胃腸道中分離得到的賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）SC02中EC水解酶進行純化后獲得了純酶。經驗證，此酶可耐受高濃度的酒精和鹽分，因此具備在醬油中消除EC的開發潛力。卜攀攀[38]從鼠胃中分離到了一株肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），特點在于其能夠產耐高滲EC水解酶，學者對該酶純化后并深究該酶的性質。研究表明，該酶在NaCl含量18%的條件下仍能保持40%的活性，因此應用在去除醬油中EC這一領域具有無限的潛在價值。可是該酶不易耐受酸的脅迫，在環境pH＜6時，酶活性顯著下降。因而，該酶需要經過耐酸性改造后方可適用于醬油生產。以上這些減除策略為醬油生產中直接消除EC奠定基礎的同時還提供了不少新的出路。

5 展望

目前，針對于醬油中EC的檢測方法未趨成熟，還不夠穩定、快速和可靠；大多數仍停留于實驗室階段，還不足以投入到大型生產當中。與本文所綜述的檢測手段相比較而言，酶聯免疫吸附檢測則具有高特異性、高靈敏度、簡單快速、成本低等優點，目前對EC的酶聯免疫檢測技術的研究還很缺乏，可以考慮利用單克隆抗體提高酶聯免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術的特異性，研發一款高效實用的EC快速檢測試劑盒，方可作為傳統檢測方法的一個重要的補充手段[39]。

盡管現有條件已檢出存在EC，但其生成的各種條件及影響因素還有待加強研究證實，才能更好地完善減除EC的措施。下一步可以考慮在醬油發酵中直接添加某種安全的化學物質抑制EC的合成或者研發可以降低EC的食品添加劑（如天然提取物），均可作為未來的研究熱點及趨勢[40]。另外，不僅要確保減除EC含量，更要保證醬油產品的感官品質、營養價值以及貯藏期等問題，往后進一步研究不同減除技術對其貨架期的影響也是很有必要的。這些舉措將有利于我國盡快建立有關發酵食品中EC的安全標準體系，同時也為醬油行業的發展保駕護航[41]。