鰱鳙引入對于稻蝦綜合種養水體微生物多樣性的影響研究

趙黎明， 呂 瑛， 李旭東， 付勇浩， 王樂平

（1.河南省水產技術推廣站， 鄭州450000； 2.駐馬店市農業農村局， 河南駐馬店463000；3.羅山縣水產局， 河南信陽464200）

1 前言

隨著人們的生活水平提高和對生活娛樂社交的需要，小龍蝦因其味道鮮美、營養價值高，備受人們青睞[1]。隨著近年來種養結合的水產生產方式在全國范圍內得到推廣，稻蝦綜合種養的面積逐年上升[2]，不僅優化了種養模式，還給農戶帶來了經濟效益[3]。近年來，稻蝦養殖越來越受到稻田環境惡化、藍藻和青苔暴發、五月瘟疫等的影響，多營養級綜合種養是近年來隨著稻田綜合種養被提出的一個發展方向，通過豐富稻田中的養殖品種，在稻田內形成不同營養層次物種的立體綜合養殖，從而有效提高餌料利用率、減少養殖有害物質積累，最終實現綠色安全種養的一種新型養殖模式。

微生物在養殖水環境中起著重要的作用[4]，廣泛參與水體中的物質循環[5，6]，參與氨化、硝化、氧化、反硝化等作用的微生物更是與養殖的成敗息息相關[7]。其在水產養殖中具有重要作用，其群落多樣性研究也較多[8]。目前對于微生物單純的培養分離方法已經不能滿足研究的需求，逐漸被高通量測序技術為基礎的微生物多樣性分析方法所替代；近年來，基于高通量測序技術的DNA宏條形碼技術在微生物群落多樣性研究中被廣泛應用[9]。

為了優化稻蝦綜合種養環境，提升養殖成功率，我們利用多營養級綜合種養的原理，在稻蝦綜合種養模式下，增加濾食性魚類鰱、鳙，形成新型多營養級稻蝦綜合種養模式。本研究中，我們利用二代測序技術，對不同模式下稻田水體微生物多樣性開展比較研究，以期了解鰱鳙的引入對于稻田養殖系統的影響。

2 實驗材料與方法

2.1 模式對比實驗設計

2019年5～9月，在河南省信陽市羅山縣廟仙鄉設置試驗田10塊，每塊試驗田的面積為160 m2。其中1、2、3試驗田為稻蝦共作，4、5、6、7試驗田為稻蝦魚（鰱、鳙）共作，8、9、10試驗田是水稻種植。水稻之間的株距為30cm，溝深為0.8m，水中稻田水位高15 cm，環溝內種植伊樂藻。為了防止小龍蝦在稻田內逃逸，在每塊稻田之間增加防逃措施，田埂四周用塑料網布建防逃墻，下部埋入土中20cm，上部高出田埂0.6 m，每隔1.5 m用木樁或竹竿支撐固定，網布上部內側縫上寬度為30 ㎝左右的塑料膜形成倒掛，以防小龍蝦逃逸[10]。

2019年5月15日種植水稻，9月20號進行收割。水稻栽種后進行施肥，每塊試驗田用5 kg菜籽餅和2.5 kg復合肥，在養殖期間不得在池塘中施肥或者噴灑各種農藥。水稻栽種一周后在1～7號試驗田中放入小龍蝦苗，放養的規格為100只/kg，投放密度按照7.5萬尾/hm2。在3-7號試驗田放入鰱、鳙，每個田塊放入100 g的鰱、鳙魚種各10尾；小龍蝦放養后及時投喂飼料。在6月15日之前每天傍晚投喂1次，按體重的2%進行投喂，6月15日之后每天投喂2次，按體重的2%進行投喂。在種養殖期間，10個試驗田的日常管理必須保持一致，包括每日飼料的投喂量，注水量等。

2.2 樣品的收集和總DNA的提取

在養殖后期2019年8月30日對試驗田水樣進行采集。使用0.22 μm微孔濾膜對水樣進行過濾，收集水體中的微生物，低溫冷藏保存。上述濾膜樣品剪碎，將其在研缽中用液氮磨至粉狀，使用CTAB法對總DNA進行抽提，將得到的DNA置于-20 ℃保存備用。

2.3 16s rDNA序列擴增

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA質量，利用定量檢測試劑盒(型號Qubit2.0 DNA)對基因組DNA進行精確定量，根據檢測結果確定PCR反應的模板DNA添加量。利用16S rRNA基因具有保守序列的特點， 用 通 用 引 物 (MSQ341F-91:CCTACAC -GACGCTCTTCCGATCTN (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG，Miseq-805R:GACTGGATTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC)擴增16S rRNA基因的V1～V3 區。將5 μLPCR反應緩沖劑、1 μLdNTP、2 μL上游引物、2 μL下游引物、1 μL模板DNA、0.5 μLTaqDNA聚合酶、38.5 μLH2O混合均勻后離心5 s，將配置好的PCR體系進行PCR擴增，用94 ℃變性3 min，94 ℃變性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30輪，進行PCR。最后一輪循環結束后，在72 ℃下最后延伸5 min，能夠讓反應產物擴增充分。PCR的產物應在PCR結束后進行瓊脂糖電泳檢測，對擴增后得到的DNA產物純化回收。

2.4 高通量測序

利用Miseq測序平臺對擴增文庫進行雙末端測序，對測序得到的結果進行數據質量控制，最終得到有效數據。利用序列分析軟件根據序列間的相似性對得到的數據進行比對注釋，后續生物信息統計采用97%相似度水平(屬水平) 下得到的操作單元（OTU）進行分析，將序列分成不同的OTU。

2.5 生物學數據分析

對不同實驗組的樣品OTU序列進行鑒定，獲取物種的信息。分析各個樣品中的優勢種群及其組成情況，進行比較。對物種的多樣性進行測定。采用香農指數（Shannon index）來估算樣品中微生物群落多樣性。各樣品微生物組成用柱狀圖表示，可以看到不同樣品中不同微生物所占有的百分比。使用SPSS 18.0對微生物群落結構進行主成分PCA分析，得到因子得分數并進行PCA散點圖繪制。

3 結果

3.1 高通量測序基本情況

通過總DNA提取、PCR檢測各樣品中微生物的DNA，對實驗組內微生物多樣性展開測序，序列數據經過質控和過濾得到有效數據，得到有效數據共計409879 條。

3.2 多樣性分析

通過對樣品Alpha多樣性分析，可以反映該區域內微生物群落的豐富度和多樣性。豐富度由群落中OTU數目可以反映出來。從圖1可以看出不同稻田綜合種養模式下微生物的豐富度無明顯規律，并沒有因為稻田內養殖物種的不同產生明顯的變化。群落的多樣性可由香農指數來反映。稻蝦養殖的微生物群落多樣性要高于其他兩個模式下的試驗田（如圖1）。

3.3 物種的組成和優勢類群分析

數據分析得到的OTU可以歸入到伯克氏菌目（Burkholderiales）、甲基球菌目（Methylococcales）、紅環菌目（Rhodocyclales）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、嗜甲基目（Methylophilales）、奈瑟氏菌目（Neisseriales）、放線菌目（Actinomycetales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）、噬纖維菌目（Cytophagales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）。伯克氏菌目、鞘氨醇桿菌目、放線菌目、黃桿菌目是所有樣品中的優勢種。

3.4 群落結構分析

對樣品數據進行主成分分析，得出分析圖（圖2）。群落分析的PCA圖顯示各微生物群落按照種類模式較好的聚類在一起。

4 討論

從香農生物多樣性指數分析表明稻蝦共作微生物多樣性較高，而水稻單作和稻蝦魚共作模式下水體微生物群落多樣性較低。這可能是由于相比于水稻單作，小龍蝦的爬行擾動、攝食等行為，可能促進了環境中微生物的多樣性上升，而鰱、鳙混養后，系統內部的營養循環進一步得到優化，而碳源的總量降低，因此為微生物多樣性受到了限制。三組試驗模式下共同的優勢種有4 種，分別是：伯克氏菌目（Burkholderiales）、鞘氨醇桿菌目（Sphingobacteriales）、放 線 菌 目（Actinomycetales）、黃 桿 菌 目（Flavobacteriales）。稻蝦魚共作與其他兩組的主要區別優勢種為噬纖維菌目（Cytophagales）和根瘤菌目（Rhizobiales）。在5#樣品中未出現根瘤菌目（Rhizobiales）可能是因為在取樣的過程中選擇的地點和位置略有不同。從PCA分析圖中可以看出，3個模式下水體微生物群落多樣性具有很明顯的差異，表明養殖生物的引入對于稻田水體微生物的影響較大。而稻蝦魚組和另外兩個實驗組的離散程度較大，說明鰱鳙的引入可以極大的改變水體微生物多樣性的組成。