基于慣性聚焦的細胞計數微流控芯片*

張會寅，郭鐘寧，鄧 宇，黃志剛，鄔澤聿

（1.廣東工業大學機電工程學院，廣州 510006；2.廣東工業大學省部共建精密電子制造技術與裝備國家重點實驗室，廣州510006；3.廣州市非傳統制造技術及裝備重點實驗室，廣州 510006）

0 引言

細胞計數在醫學、農業、環境評估、食品生產等領域有著廣泛的應用[1-4]。細胞計數的其中一個應用為牛奶體細胞計數。一般情況下，即使是健康的奶牛，生產的牛奶也含有少量乳腺凋亡的細胞。如果牛奶中的體細胞濃度增大，那么奶牛患乳房炎的概率將大大增加。而且牛奶中的體細胞增多，對牛奶的口感和質量影響很大[5]。目前細胞計數的方法有顯微計數法、圖像計數法[6]、阻抗計數法[7]、流式計數法[8]等。其中阻抗計數法和流式計數均為絕對計數，即細胞逐個通過檢測位，相關傳感器檢測到細胞通過而計數。因此如何使細胞單個通過檢測位置和精確感應單個細胞信號是細胞計數精度的關鍵。

微流控芯片即芯片上的實驗室，力圖將傳統檢測微型化、自動化、便攜化。微流控技術中，有一種被動粒子控制技術叫慣性聚焦，帶有微米級粒子通過設計的流道即可實現粒子的排序。然而慣性聚焦對粒子大小的選擇性較大，不同粒徑大小的粒子在同一流速下，通常聚焦的位置是不一樣的，因此很多人利用這一特性進行粒子分選。也有人提出使用慣性聚焦作為細胞計數的細胞聚焦方式，研究單一粒徑的微粒子模擬細胞聚焦的可行性[9]。然而一般情況下細胞的大小是有差別的，單一粒徑微球的聚焦模擬實驗并不能完全代表實際情況。

本文根據細胞大小及慣性聚焦理論設計慣性聚焦微流道，然后以極限尺寸以及平均細胞大小的聚苯乙烯微顆粒探究聚焦規律。利用得出的單一粒子的聚焦規律，選擇合適的流速，用混合粒子驗證聚焦效果。

1 慣性聚焦理論及流道設計

慣性聚焦分直線慣性聚焦和彎道慣性聚焦。由于直線慣性聚焦的平衡位置一般為多個[10]，而彎道慣性聚焦存在二次流，平衡位置只有一個[11]。因此為實現單一細胞通過檢測位置，彎道慣性聚焦較合適。彎道慣性聚焦中，有螺旋型[12]、正弦型[11]、方波型[13]等聚焦流道。由于螺旋型聚焦流道設計比較復雜，方波型聚焦流道比較適合粒子分離，因此本文嘗試采用正弦型流道作為多粒子聚焦流道。

1.1 慣性聚焦理論

正弦型流道聚焦流道COMSOL流場仿真截面如圖1（a）所示，可以看到垂直于截面的速度場左右流速不對稱，左側的速度梯度大于右側。除了垂直截面的速度，還存在截面方向的速度，如圖中箭頭所示。粒子在這樣非對稱慣性聚焦流道中，受到由速度梯度和壁面的作用形成的慣性升力FL，以及由二次流作用產生的斯托克斯曳力，也稱迪恩曳力FD[11]，如圖1（b）所示。其中慣性升力FL的表達式如下：

式中：ρ為流體密度；Um為流道中最高流速；CL為升力系數，和粒子在流道截面中的位置有關；a為粒子直徑；Dh為流道水力直徑。

圖1 COMSOL流場仿真流速分布和粒子在二次流中受力示意圖

迪恩曳力FD的表達式如下：

式中： μ為流體的動力黏度；UD為二次流的平均流速；a為粒子的直徑。

影響粒子聚焦的力主要為以上兩個力，而這兩個力的大小和粒子所處的位置相關，當慣性升力和迪恩曳力相等，則此時粒子所處的位置就是粒子的平衡位置。

1.2 流道設計

實驗表明，粒子直徑a和流道的水力直徑Dh需要滿足以下條件才能實現粒子聚焦[11]。

式中：w為流道寬度；h為流道深度。

對于直徑為7μm、10μm、12μm的微球，設計了如圖2所示流道，深度為50μm，大彎道平均半徑和寬度為665μm和400μm，小彎道平均半徑和寬度為200μm和200μm。高速攝影位置為如圖2所示聚焦末端。

圖2 流道示意圖

2 聚焦實驗

2.1 單一粒徑粒子實驗及結果分析

用聚苯乙烯微球模擬細胞進行實驗。聚苯乙烯微球為天津市倍思樂色譜技術開發中心的Unibead單分散相聚苯乙烯微球。正常牛奶體細胞濃度為20萬個/mL～30萬個/mL[5]。分別將7μm、10μm、12μm配置為25萬個/mL，然后分別以50μL/min的速度梯度，從100μL/min到1 000μL/min注射微顆粒。高速攝影儀拍攝視頻，采集頻率4 000 Fps，曝光時間15μs，然后用ImageJ疊加視頻幀，觀察相應速度粒子的位置分布情況。

圖3所示為7μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于550μL/min時，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當流速大于或等于550 μL/min時，粒子可靠聚焦。圖4所示為10μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于500μL/min時，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當流速大于或等于500μL/min時，粒子可靠聚焦。圖5所示為12μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于350μL/min時，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當流速大于或等于350μL/min時，粒子可靠聚焦。

圖3 7μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

圖4 10μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

圖5 12μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

在正弦型聚焦流道的單一直徑粒子聚焦中，聚焦的本質為粒子在流體中，慣性升力和迪恩曳力的平衡，而平衡位置只有一個。單一粒子的聚焦，粒子軌道相同，而且粒子不可能同時存在同一位置，因此粒子與粒子之間存在相互作用，使得粒子之間總是存在一定的間距。因此，為進一步說明聚焦的聚焦效果，如圖6所示，本文定義了聚焦寬度和聚焦軌道位置為評價粒子聚焦效果，聚焦寬度為視頻幀疊加圖的疊加軌跡寬度；聚焦位置為聚焦中心到流道內側的距離。使用ImageJ的Plot Profile功能對視頻幀疊加圖進行灰度分析。測量粒子軌跡的寬度以及聚焦中心位置，測量出來的寬度以及中心位置趨勢如圖7和圖8所示。

圖6 聚焦寬度d和聚焦位置h示意圖

圖7 流速與微球粒徑對聚焦寬度的影響

圖8 流速與微球粒徑對聚焦中心位置的影響

聚焦寬度趨勢如圖7所示，在可以實現微顆?？煽烤劢沟牧魉傧?，隨著流速的增加，7μm、10μm、12μm的微粒子聚焦的寬度均有成線性變寬的趨勢。其中7μm微球聚焦寬度變化率最大，流速從550μL/min變化到1 000μL/min，微球聚焦寬度從23.99μm變化到55.1μm；10μm微球聚焦寬度變化率次之，流速從500μL/min變化到1 000μL/min，寬度從27.3μm變化到39.9μm；12μm寬度變化率最小，流速從350μL/min變化到1 000μL/min，微球聚焦寬度從19.6μm變化到34.5μm，聚焦寬度基本保持恒定。

聚焦位置趨勢如圖8所示，在可以實現微顆?？煽烤劢沟牧魉傧拢瑹o論粒徑大小，粒子聚焦軌道的中心位置明顯有隨流速的增大而線性增大的趨勢。這是因為當流速增大，由于二次流的流速增大，由式（2）可知，迪恩曳力會增大。由式（1）可知，慣性升力的大小除了和流速有關以外，還和升力系數相關，升力系數在一定范圍內，偏離側壁距離越大，系數越大[14]，因此平衡位置會隨著流速增大而偏離內側壁。

2.2 混合粒子實驗

相對于單一粒子聚焦，多粒子聚焦由于粒徑的差異導致聚焦軌道出現差異，另外粒子之間的距離要盡量大，而粒子之間的距離產生原因為同一軌道上粒子之前的相互作用。因此對于多粒子聚焦要使得粒子的聚焦軌道差異盡量小，聚焦寬度盡量小，才能很好地控制粒子之間的距離。結合圖7和圖8，將3種粒子的軌道進行疊加，得到如圖9所示的粒子軌道疊加寬度圖。在流速為550μL/min時，此時軌道最能滿足軌道相近，聚焦寬度小的條件。在這個流速下，3個軌道疊加的寬度為32.213μm，聚焦位置為51.907μm。

混合3種粒徑的粒子，以550μL/min流速進行實驗。觀測粒子的聚焦情況，與單一粒子聚焦疊加軌道進行對比。實驗效果圖10所示。圖10（a）為高速攝影儀拍攝的視頻幀，可以看到，粒子可以實現粒子間距拉開。圖10（b）為高速攝影儀拍攝的視頻幀疊加圖，可以看到，粒子可以實現穩定聚焦，穩定聚焦的寬度為32.8μm，聚焦位置為51.45μm，和單一粒子聚焦軌道的疊加相近。

圖9 粒子軌道疊加寬度圖

圖10 混合粒子聚焦實驗

3 結束語

采用實驗方法，研究單一粒子在慣性聚焦流道中，不同流速的情況下，粒子的聚焦寬度及聚焦軌道位置。另外混合多種粒子實驗，驗證了多粒子在同一慣性聚焦流道聚焦的可行性。

（1）同一粒子在同一慣性聚焦流道中聚焦，流速到達一定值才能實現可靠聚焦；粒子直徑越小，需要的流速越高；流速越高，粒子的聚焦寬度越大；聚焦的中心位置，越偏離流道內側壁。

（2）混合粒子在設計的流道能實現穩定間距聚焦，其軌道可以通過粒子單一粒子的軌道的疊加預測聚焦軌道和寬度。和傳統的細胞計數流道相比，本流道可以實現鞘液聚焦的效果，為細胞絕對計數提供基礎，省去鞘液的注射，簡化細胞計數液路。