松蘿酸對3種腫瘤細胞增殖和凋亡的影響

于大永，郭秀磊，高鴻雁，曹 鶴，史麗穎

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連116622）

松蘿酸是地衣類植物中常見的一種代謝產物，為二苯丙呋喃類化合物.1844年，德國科學家W.Knop首次在地衣中發現松蘿酸并分離出來，1933年開始被人工大量合成[1].松蘿酸有2種對應異構體，分別為（-）-松蘿酸和（+）-松蘿酸[2].松蘿酸主要存在于松蘿等地衣植物中，這種地衣植物在我國主要分布于新疆、甘肅、陜西等地.松蘿酸具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-4]，常被用作牙膏和化妝品的添加劑.在美國，其鈉鹽一般用作補充劑來控制體重[5].以往對于松蘿酸的研究主要集中在抗菌、抗炎、抗病毒等方面，近年來關于松蘿酸抗腫瘤方面的研究逐漸增多.如郝凱華等[6]研究發現，松蘿酸能夠抑制小鼠H22細胞的增殖以及血管生成，明顯抑制了VGEF和bFGF的表達；Geng等[7]對肺癌細胞BGC823和SGC7901的研究表明，松蘿酸能夠引起細胞發生G1期和G2期阻滯，從而使細胞發生凋亡；左舒婷[8]研究發現，松蘿酸能夠體外特異性地殺死乳腺癌細胞.

白血病是發生于血液和骨髓中的惡性腫瘤，由于白血病細胞具有可以避免生長停滯和終末分化的特性，因此白血病治愈的難度非常大[9-11].骨肉瘤是較常見的發生于青少年或兒童的一種惡性骨腫瘤，根據最新的癌癥統計數據，骨肉瘤在美國最常見的兒童和青少年癌癥中存活率最低[12-13].惡性黑色素瘤是一種侵襲性和治療抵抗性黑色素細胞惡性腫瘤[14]，在世界范圍內發病數量約占所有惡性腫瘤的3%.為了進一步挖掘松蘿酸在腫瘤治療方面的應用潛力，本研究分別以人白血病細胞U937、人骨肉瘤細胞MG-63和人黑色素瘤細胞A375這3種腫瘤細胞為材料，通過MTT實驗檢測松蘿酸對這3種細胞增殖的抑制情況，并篩選出抑制效果最好的細胞.同時，利用Hoechst 33342染色和Western Blot方法，初步研究松蘿酸對腫瘤細胞增殖的抑制作用機制，為松蘿酸抗腫瘤的新藥開發及其臨床應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株

人白血病細胞U937，Human Sciences Research Bank（日本人類科學基金會，日本東京）；人骨肉瘤細胞MG-63，大連大學醫學院；人黑色素瘤細胞A375，大連大學生命科學與技術學院.

1.1.2 主要試劑

松蘿酸，阿拉丁試劑公司；MTT、DMSO、Caspase-3、GAPDH和抗體，生工生物工程上海股份有限公司；Hoechst 33342染料，北京索萊寶試劑公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu），天津金耀氨基酸有限公司；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，瑞士Roche公司；BCA Protein Assay Kit，碧云天生物技術研究所；超敏ECL化學發光試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；Bax抗體、Bcl-2抗體和HRP標記山羊抗兔IgG，武漢博士德生物有限公司.

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱，新加坡ESCO公司；酶標儀、ini-PROTEN system Casting stand制 膠 器、Mini-PROTEN Tetra System電泳槽和PowerPacTM Basic電泳儀，美國BIO-RAD公司；SYGN2/7503化學發光凝膠成像系統，英國基因公司.

1.2 方法

1.2.1 藥品的制備

松蘿酸（相對分子質量為344.32）溶于一定量的DMSO中，使母液的濃度為50 mmol/L（DMSO的終體積分數小于0.5%），除菌后-20℃保存.

1.2.2 細胞株的培養

用含有滅活的胎牛血清（體積分數為10%）的RPMI-1640培養基培養U937細胞；用含有10%滅活的胎牛血清的DMEM培養基培養MG-63和A375細胞.3種細胞均在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行培養，每2 d換液1次，每3 d傳代1次，使細胞一直保持在對數生長期，以便用于后續實驗.

1.2.3 MTT法對藥物增殖抑制作用的測定

選取處于對數生長期的上述3種細胞，臺盤藍染色，利用血球計數板計數，選取存活率不低于95%的細胞進行實驗.調整U937細胞的濃度為4×104mL-1，MG-63和A375細胞的濃度均為2×104mL-1，接種于96孔板中.MG-63和A375細胞培養12 h后用松蘿酸處理，U937直接用松蘿酸處理.用無血清的培養基稀釋松蘿酸母液，使其濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L，依次加入96孔板中，陽性對照組中加入5-氟尿嘧啶（終濃度為100μmol/L）.于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養24 h和48 h.松蘿酸處理終止前4 h加入10μL的MTT溶液（5 g/L），相同條件下培養4 h后向含有U937細胞的96孔板中加入200μL的鹽酸-SDS-異丁醇三聯液，繼續在相同條件下培養過夜，利用酶標儀在570 nm處測定吸光度值OD570.將含有A375和MG-63細胞的96孔板倒掉上清液，吸去多余液體，每孔加入200μL的DMSO，在搖床上搖晃20 min后于490 nm處測定吸光度值OD490.計算抑制率，實驗重復3次.

1.2.4 細胞凋亡形態學觀察

調整細胞濃度為3×105mL-1，向6孔板中加入處于對數生長期的U937細胞，利用不同濃度梯度的松蘿酸（0、50、75、100μmol/L）處理6 h后，對照組中加入5-氟尿嘧啶.加入適量的Hoechst 33342溶液（1 mg/mL），使得工作質量濃度為2μg/mL，避光染色10 min，收集細胞，利用PBS清洗3遍，用熒光顯微鏡（日本Nikon公司）拍照.

1.2.5 Western Blot檢測蛋白變化

選取處于對數生長期的人白血病細胞U937，調整細胞濃度為2×106mL-1，接入6孔板中，加入待測的藥物松蘿酸使其終濃度分別為50、75、100μmol/L.加藥處理6 h后，加入150μL的蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，用Western Blot法測定促凋亡蛋白Bax、逆凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3以及GAPDH的表達，利用Image J軟件分析灰度值.

1.3 數據統計

實驗重復3次.利用SPSS 25.0進行單因素方差分析，采用LSD檢驗進行多重比較.以0.01＜P＜0.05為差異具有統計學意義，P＜0.01為差異具有高度統計學意義.

2 結果與分析

2.1 松蘿酸對3種腫瘤細胞增殖的抑制作用

不同濃度的松蘿酸對3種腫瘤細胞增殖的抑制情況如表1所示.

表1 松蘿酸對3種腫瘤細胞的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of three kinds of tumor cells treated with usnic acid %

由表1可以看出，隨著處理濃度的增加，松蘿酸對3種細胞增殖的抑制作用均增強，且與對照組的差異多數具有統計學意義（P＜0.05）.這表明松蘿酸對3種腫瘤細胞均有增殖抑制作用并且呈現出劑量依賴性.不同濃度處理組中，松蘿酸對3種細胞的抑制率總體上隨著處理時間的延長而增加.

計算松蘿酸對3種腫瘤細胞的IC50值，結果如圖1所示.

圖1 松蘿酸對3種腫瘤細胞的IC50值Fig.1 IC50 value of three kinds of tumor cells treated with usnic acid

由圖1可以看出，3種細胞在處理48 h時的IC50均低于24 h時的數值，即松蘿酸對3種腫瘤細胞的抑制作用具有時間依賴性.作用24 h時，U937、A375和MG-63的IC50分別為90.90、139.48和103.00μmol/L；作用48 h時，3種細胞的IC50分別為54.08、65.39和90.48μmol/L.比較3種腫瘤細胞的IC50可知，松蘿酸對人白血病細胞U937的抑制效果最好.

2.2 細胞凋亡形態學觀察

不同濃度的松蘿酸處理人白血病細胞U937 6 h后，細胞生長情況如圖2所示.

圖2 松蘿酸對人白血病細胞U937凋亡形態學的影響（×200）Fig.2 Effect of usnic acid on the apoptotic morphology of U937（×200）

由圖2可以看出，同對照組相比，50μmol/L處理組中細胞就已經出現了明顯的凋亡特征，細胞核的體積縮小，細胞核裂解并伴有凋亡小體.隨著松蘿酸濃度的增加，細胞裂解地更加充分，凋亡細胞數量顯著增加.

2.3 Western Blot檢測凋亡蛋白的表達情況

利用Western Blot檢測松蘿酸處理下腫瘤細胞凋亡相關蛋白的變化，結果如圖3所示.

圖3 松蘿酸處理U937 6 h后凋亡相關蛋白的變化Fig.3 Expression of proteins related with apoptosis in U937 cells treated with usnic acid for 6 h

由圖3可以看出，隨著松蘿酸處理濃度的增加，促凋亡蛋白Bax的表達量上調，50、75和100μmol/L處理組中的Bax表達量均顯著高于對照組（P＜0.05）.逆凋亡蛋白Bcl-2和Caspase-3的表達量均隨著松蘿酸處理濃度的增加而顯著下降，3個處理組的表達量均顯著低于對照組.由于Bax的表達量上升Bcl-2的表達量下降，導致Bax/Bcl-2比值增大.

3 討論

本研究用不同濃度的松蘿酸處理人白血病細胞U937、人骨肉瘤細胞MG-63和人黑色素瘤細胞A375，探究松蘿酸對這3種腫瘤細胞增殖的抑制效果.結果發現，松蘿酸對3種腫瘤細胞均有增殖抑制作用，并呈現出劑量和時間依賴關系.比較松蘿酸對3種腫瘤細胞的抑制效果，發現松蘿酸對人白血病細胞U937的抑制效果最好，其次是人黑色素瘤細胞A375.通過Hoechst 33342染色發現松蘿酸能夠誘導人白血病細胞U937發生凋亡，從而抑制其生長.

左舒婷[8]的研究表明，松蘿酸體外特異性地殺死乳腺癌細胞主要是通過ROS介導的線粒體凋亡實現的.Fan等[15]研究發現，松蘿酸對2個髓性白血病細胞系中Mnk1/el F4E和Pim-1/4E-BP1的信號傳導作用均有抑制作用，可能是一種潛在的原癌基因Pim-1抑制劑.Galanty等[16]研究松蘿酸對前列腺癌細胞和黑色素瘤細胞HTC-140的作用，發現松蘿酸除了具有抑制細胞增殖的作用外還可抑制腫瘤細胞的遷移，這使得松蘿酸有望被用于針對腫瘤細胞轉移級聯反應過程的治療.

利用Western Blot檢測松蘿酸處理人白血病細胞U937后腫瘤相關蛋白包括Bax、Bcl-2、Caspase-3的變化.Bcl-2家族是細胞凋亡的重要調節因子，可通過調控線粒體膜的透性控制線粒體凋亡，該家族成員包括促凋亡蛋白（如Bax）和逆凋亡蛋白（如Bcl-2）[17-18]，二者比值決定細胞的命運，如果比值變大，即增加Bax表達或降低Bcl-2的表達，就會促進細胞凋亡.半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族在細胞凋亡過程中也發揮著重要作用，Caspase-3是細胞凋亡的主要效應者[19-21].本研究發現，松蘿酸處理U937后，細胞中Bax蛋白的表達量上升，Bcl-2蛋白的表達量降低，Caspase-3蛋白表達量下調，Bax/Bcl-2比值增大，即松蘿酸也是通過Caspase依賴性線粒體途徑誘導人白血病細胞的凋亡.