國產DNA測序儀及提取試劑在接觸DNA檢驗中的應用

李濤 張丹丹 焦靈霞 河南省周口市商水縣公安局

引言

隨著科技的發展、網絡的普及、法制化的推進，高智商犯罪越來越多，嫌疑人能夠獲取更多的反偵察技術，嫌疑人在現場遺留的指紋、有價值的足印、血跡在現場已經很難提取到，加上嫌疑人的刻意偽裝回避、不攜帶通訊工具等手段，現場視頻、技術偵查手段也無從使用，此時犯罪現場接觸DNA的提取和檢驗就顯得尤為重要。接觸DNA檢材屬于微量疑難生物檢材，其檢驗是法醫DNA檢驗的難點和熱點[1]，隨著微量檢材數量日益增多，如何提高接觸DNA的檢驗成功率，成為每個DNA實驗室都要面臨的關鍵問題。

一、接觸DNA檢驗方案

以往文獻對于接觸DNA檢驗成功率的報道結果差異較大，從9%到45%不等[2]。由于接觸DNA檢測步驟復雜，檢驗成功率易受各環節多因素影響，導致檢驗成功率差異很大，接觸DNA檢材從檢測流程上來講與其它常見生物檢材并無差異，同樣可分為提取、擴增、電泳及結果分析等步驟，但接觸DNA檢驗在上述環節的具體操作上有其特殊性，包括關鍵接觸部位的確定與發現、接觸DNA的提取與純化、擴增參數的選擇、電泳參數的設定、結果的分析與運用等，對實驗人員的技術水平提出了較高要求。

對于接觸DNA檢驗，在前處理環節上，應結合具體案情分析和載體的物理特性，有針對性的選擇兩步擦拭、直接剪取、膠帶粘取、真空吸附、震蕩沖洗等合適的方法進行前處理；在提取環節上，可選用常見的磁珠法、硅珠法、Chelex-100等，目前有很多商業化的試劑盒及提取工作站可供選擇，常見的提取試劑盒如DNA IQTM試劑盒、QIAampTMDNA Investigator試劑盒、D盾超敏提取試劑盒、超高效硅珠純化DNA提取試劑盒等，同時許多核酸自動提取儀如KingFisherTM、 QIACubeTM、 MagNA PureTM等都提供配套的純化試劑盒可供選擇[2]，為得到更高純度的接觸DNA，還可以通過調整洗脫液體積或采用離心超濾管與配套試劑盒進行濃縮[3]；PCR擴增環節可以采用增加循環數、縮小反應體系、優化引物、延長退火時間、改變緩沖體系等不同的方法來提高檢驗靈敏度；電泳檢測可通過增加上樣量（提高上樣電壓或增加進樣時間）、增大激光器功率、使用高質量甲酰胺等方法改善電泳質量；數據分析環節可采取降低分析閾值、進行重復檢驗認定多次出現的等位基因等方法謹慎研判和應用DNA分型結果。

商水縣公安局DNA實驗室自2017年底投入使用以來，采用D盾超敏DNA提取試劑盒[4]、 PowerPlexTM21和VeriFilerTMPlus擴增試劑盒、國產GA118-16A型遺傳分析儀進行接觸DNA檢驗，取得了較好的檢驗效果，在打擊犯罪、維護社會穩定方面效果明顯。

二、典型應用案例

（一）案例資料

2019年9月27日，商水縣某村村民蘇某家的狗在門口被人盜走，因涉案價值不夠立刑事案件，派出所民警未通知技術人員出現場，從蘇某家大門口地面上提取毒鏢（1號檢材）一枚。

2020年4月26日，村民郭某某家院內養的杜賓犬被盜，價值10000多元，技術人員現場提取嫌疑人翻墻木梯子上粘取物（2號檢材）1份、綁有雞頭的藥狗蛋（3號檢材，圖1）1個、毒鏢（4號檢材，圖1）1枚。

（二）接觸DNA檢驗

1.檢材前處理及DNA提取

（1）毒鏢（1號檢材）：對毒鏢針管管身用脫落細胞粘取器分段粘取后，用棉簽分干濕兩步擦拭提取，之后將粘取器上粘性膠片、棉簽擦拭物放入1.5ml離心套管中，加入200 μL裂解液，漩渦振蕩10s后56℃孵育30min，再99℃裂解10min。裂解結束后17000g離心3min，棄除離心套管，加入1000 μL吸附液和20 μL吸附珠，室溫靜置15min后8000g離心30s去除上清液，再向沉淀物中加入-20℃漂洗液800 μL，將沉淀物充分震開后8000g離心30s，去凈上清液，烘干，加入35 μL洗脫液，56℃孵育20min；

（2）木梯粘取物（2號檢材）：將脫落細胞粘取器上粘性膠片剝離后導入離心套管，按D盾超敏DNA提取試劑盒說明書進行提??；

（3）綁有雞頭的藥狗蛋（3號檢材）：分離藥狗蛋和雞頭，將綁線剪成小段后直接放入離心套管，再對膠囊部分用棉簽分干濕兩步擦拭提取，提取盡量避開油污，按D盾超敏DNA提取試劑盒說明書進行提取；

（4）毒鏢（4號檢材）：對毒鏢針管管身分段粘取后用棉簽分干濕兩步擦拭提取，之后粘取器上粘性膠片、棉簽擦拭物分開放入1.5ml離心套管中；針管與尾翼結合處的纏繞膠帶，先用棉簽擦拭后用鑷子剝離管身，分段剪開，將碎片和棉簽分開放入1.5ml離心套管，其余處理步驟同1號檢材。

2.PCR擴增

1號檢材用PowerPlexTM21試劑盒進行擴增，擴增總體積10 μL，DNA模板6 μL；2、3、4號檢材用VeriFilerTMPlus試劑盒擴增（與1號檢材檢驗時間不同），擴增總體積10μ L，DNA模板7 μL，其余操作按試劑盒說明書要求進行。

3.電泳檢測

上述擴增產物在GA118-16A型測序儀上按標準程序進行電泳檢測，應用GeneMapperTMID-X 1.4分析軟件進行分析（分析閾值50RFU）。

4.結果

經過檢驗，1號檢材上檢出1名男性DNA分型，如圖2所示，經數據庫查詢比中前科人員申某某，嫌疑人抓獲歸案后經采血檢驗，證實申某某為該盜竊案件嫌疑人；2、3、4號檢材上分別檢出同一男性DNA分型，如圖3所示，經數據庫查詢，比中前科人員顧某某，到案后經采血檢驗，證實顧某某確為該盜竊案件嫌疑人。

三、討論

接觸DNA檢驗作為一門新興技術，應用前景廣闊，在未來的案件偵破中會發揮越來越重要的作用。許多接觸性檢材無法檢出有效分型，其原因可能有多方面，商水縣公安局DNA實驗室在三年多的檢驗工作中主要遇到以下三方面問題：檢出多人混合造成的分型無法判讀、抑制物較多造成的無法檢出、DNA含量過低造成的無法檢出。

針對上述三個問題，筆者總結出如下應對辦法：

1.為了避免檢出多人混合分型、應盡量縮小提取面積，分塊多次提取。如上述4號檢材毒鏢曾經被制作人、案件受害人等多人觸碰，針管管身多處檢出混合分型，通過分塊多次提取，在纏繞針管的膠帶碎片中檢出單一男性分型。

2.對可能造成擴增抑制的檢材處理時，應盡量選擇檢材較為潔凈處提取，避免提取到對擴增有抑制作用的含有酸、堿、油漆、動植物油等成分，如無法避免，應盡量少粘；提取后可對DNA先進行純化，或者擴增時做稀釋處理。如上述綁有雞頭的藥狗蛋，在帶油脂的藥狗蛋表面擦拭物上，未檢出有效分型，在綁雞頭的線繩較潔凈處進行提取，檢出1名男性的完整分型。

3.針對DNA含量過低造成的無法檢出問題，有以下幾個方面可以進行優化：

（1）為了提高檢出率，在現場勘查時應充分了解案情，根據痕跡物證指向，重點提取，提取檢材時應盡量多提幾處，針對不同檢材的潔凈程度，選擇不同力度提取；

（2）在進行DNA提取時，選用DNA提取率較高的方法，最大限度獲得DNA模板含量；

（3）在選用提取試劑時，盡量選用靈敏度較高的試劑。本文案例中所用D盾超敏DNA提取試劑盒，雖是國產試劑，通過商水縣公安局DNA實驗室三年多來的應用，其效果與進口提取試劑處于同一水平，本文案例中檢材提取模板量為35μ L，是一般微量DNA檢材提取模板量的近2倍，足以進行3次平行擴增或者3次梯度擴增用和2次YSTR擴增，保證檢驗結果的準確性。

（4）在進行電泳分型檢測時，選用靈敏度高的儀器。本文案例中的檢材均為接觸DNA檢材，使用國產提取試劑進行提取和常規擴增之后，采用國產GA118-16A遺傳分析儀進行檢測。結果表明，對于木梯、毒鏢、藥狗蛋上的脫落細胞等微量檢材都獲得了良好的分型，提取效果和檢驗質量均經得起復核[5]。

上述方法經過商水縣公安局DNA實驗室應用取得了良好的使用效果，三年多以來協助偵查人員打掉系列入室盜竊、盜竊車內財物、接觸性詐騙、搶劫等案件犯罪團伙40余個。