馬鈴薯氣孔密度表皮模式因子StSTOMAGEN的克隆和功能分析

王艷麗，謝 天，張春麗，李娟娟，劉溢健，李紅兵，殷俐娜，王仕穩(wěn)，鄧西平,，可慶波

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，陜西 楊凌 712100)

隨著全球氣候變化和生態(tài)環(huán)境的惡化，植物經(jīng)常會(huì)遭受到高溫、高鹽、干旱等各種各樣的非生物脅迫[1]，而干旱脅迫會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、地理分布以及農(nóng)作物的產(chǎn)量[2]。因此，提高農(nóng)作物的抗旱性，保證干旱脅迫下農(nóng)作物的產(chǎn)量對(duì)保障全球糧食安全具有重要意義。

氣孔是高等植物莖葉等器官表皮上由1對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞特化而成的小孔結(jié)構(gòu)，在植物蒸騰作用、呼吸作用和光合作用中發(fā)揮重要作用[3]。植物通過(guò)氣孔吸收CO2進(jìn)行光合作用，從而促進(jìn)自身生長(zhǎng)；同時(shí)，植物通過(guò)氣孔的蒸騰作用推動(dòng)物質(zhì)運(yùn)輸[4]。植物完成自身生長(zhǎng)需要在最大化光合作用效率的同時(shí)最小化水分流失[5]，所以氣孔調(diào)控對(duì)于植物生存是至關(guān)重要的。

隨著陸地植物的進(jìn)化，氣孔的形成方式也經(jīng)歷了一系列的演化[4]，但是大量研究表明植物氣孔發(fā)育都經(jīng)歷不對(duì)稱分裂、細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化、胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控事件[6]，其分布幾乎都遵循“單細(xì)胞間隔法則(One cell spacing)[7]”。轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)肽以及促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)等在氣孔發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的在氣孔發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子都是屬于類表皮模式因子家族(EPIDERMAL PAT-TERNING FACTOR-LIKE family, EPFL)的小分子分泌多肽，這些多肽通常具有N末端的分泌信號(hào)序列和C末端的相對(duì)保守的6個(gè)或8個(gè)半胱氨酸殘基, 前者在蛋白成熟過(guò)程中被剪切掉, 后者可能參與形成分子內(nèi)二硫鍵[4]。擬南芥的EPFL家族包含11個(gè)成員[9]，EPF1和EPF2是以負(fù)調(diào)控因子的作用來(lái)調(diào)節(jié)特定時(shí)期的氣孔發(fā)育。EPF1是最早發(fā)現(xiàn)的EPFL家族成員, 該基因在晚期的擬分生細(xì)胞、保衛(wèi)母細(xì)胞和早期的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，EPF2的氨基酸序列與EPF1有很高的同源性，其作用時(shí)間早于EPF1，在早期的氣孔譜系細(xì)胞中表達(dá)[10]。EPF1和EPF2都依賴類受體膜蛋白TOO MANY MOUTHS(TMM)和ER家族(ERECTA family，ERf)類受體激酶發(fā)揮功能[11]。而STOMAGEN是EPFL家族中目前已知唯一的正調(diào)控因子，其蛋白質(zhì)包括N末端分泌信號(hào)序列，前肽結(jié)構(gòu)域和成熟肽結(jié)構(gòu)域[4]。過(guò)表達(dá)STOMAGEN基因可以產(chǎn)生簇狀氣孔群, 而利用RNAi敲除STOMAGEN則使得植株幾乎不形成氣孔，這些均表明STOMAGEN能夠促進(jìn)氣孔發(fā)育[12]。與EPF1和EPF2類似，STOMAGEN發(fā)揮作用需要TMM存在。這表明STOMAGEN可能是通過(guò)與EPF1和EPF2競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合TMM從而促進(jìn)氣孔的形成[4]。前人研究表明，細(xì)胞中STOMAGEN的表達(dá)水平與氣孔密度呈正相關(guān)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)STOMAGEN可以顯著增加氣孔密度，同時(shí)植株的光合作用得到明顯改善[12]，但是STOMAGEN基因在植物逆境脅迫響應(yīng)中的作用尚不清楚。

本研究克隆了馬鈴薯氣孔密度表皮模式因子StSTOMAGEN基因，分析了該基因的表達(dá)模式，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了過(guò)量表達(dá)StSTOMAGEN基因的擬南芥株系。通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的氣孔密度和抗旱性，初步揭示StSTOMAGEN在氣孔運(yùn)動(dòng)及植物干旱脅迫響應(yīng)中的作用，以期為通過(guò)基因編輯技術(shù)改變馬鈴薯氣孔密度調(diào)節(jié)因子StSTOMAGEN基因的表達(dá)水平，培育抗旱節(jié)水型馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料有擬南芥[哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)]和馬鈴薯(大西洋品種)。將擬南芥種子在超凈臺(tái)中用75%的酒精、1%次氯酸鈉溶液消毒后，用滅菌水沖洗3次，4℃低溫處理3 d。隨后播種在MS [1/2MS+3%蔗糖+0.5%瓊脂(pH 5.6～5.8)]培養(yǎng)基，放于光照培養(yǎng)箱中(光周期為14 h/10 h，光/暗、相對(duì)濕度80%、光照強(qiáng)度120 μmol·m-2·s-1、溫度22℃)培養(yǎng)。生長(zhǎng)7 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽到基質(zhì)∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的土壤中，放置于22℃，16 h/8 h,光/暗，60%的相對(duì)濕度的溫室中生長(zhǎng)。

將繼代培養(yǎng)15 d長(zhǎng)勢(shì)一致的馬鈴薯組培苗轉(zhuǎn)移至花盆(7 cm×7 cm×6.5 cm)中，生長(zhǎng)溫度為25℃，相對(duì)濕度為60%，光周期為16 h/8 h(光/暗)，光照強(qiáng)度為120 μmol·m-2·s-1。馴化1周，將馬鈴薯苗轉(zhuǎn)移至溫室中培養(yǎng)45 d。將馬鈴薯植株的莖尖、莖、葉、根和塊莖進(jìn)行取樣，迅速放于液氮冷凍用于RNA的提取。對(duì)于不同脅迫處理，將繼代培養(yǎng)18 d的馬鈴薯組培苗移至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，3周后對(duì)植株進(jìn)行逆境處理。包括：5%的聚乙二醇(PEG6000)溶液、100 mM NaCl溶液、50 μm脫落酸(ABA)溶液，分別在處理0、1、4、8、12、16、20 h和24 h后從頂部取第二片完全展開(kāi)葉并立即置于液氮中冷凍，用于脅迫條件下基因表達(dá)模式研究。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA的提取及熒光定量PCR 采用Trizol(Invitrogen)提取馬鈴薯不同組織的總RNA，用DNase進(jìn)行純化處理。然后取2 μg純化后的總RNA，用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。得到cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，實(shí)時(shí)定量 PCR 采用QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)，用LightCycler 480 II系統(tǒng)(Roche，Basel，Switzerland)進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量分析。qRT-PCR所用的反應(yīng)體系：2× UltraSYBR Mixture 10 μL，上游引物(10 mmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，共20 μL。最后采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析，每一處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 研究所用引物序列

1.2.2StSTOMAGEN基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 以1.2.1中獲得的馬鈴薯的cDNA為模板，按照KOD Plus-Neo(Toyobo, Osaka, Japan)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因StSTOMAGEN，引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃ 變性10 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。利用SpeI和BamH I對(duì)克隆序列和表達(dá)載體pCAMBIA1305進(jìn)行雙酶切，利用DNA連接酶(TaKaRa，大連)連接獲得重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌(Agrobacterium)EHA105。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 以StSTOMAGEN基因推導(dǎo)的氨基酸序列為目標(biāo)序列在NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站上進(jìn)行BlastP分析，獲得各物種同源基因的蛋白序列，并用MEGA 6.0軟件對(duì)StSTOMAGENA蛋白序列與薺菜(Capsellarubella, XM_023779504.1)、亞麻薺(Camelinasativa, XR_757444.2)、琴葉擬南芥(Arabidopsislyrate,XM_002863154.2)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,NM_117366.4)、山崳菜(Eutremasalsugineum, XM_006414920.2)、白菜(Brassicarapa, XM_009109421.3)、石榴(Punicagranatum, XM_022160362.1)、大豆(Glycinemax, NM_001255343.2)、木薯(Manihotesculenta, XM_021776765.1)、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis, XM_021821217.1)、猩紅猴面花(Erythrantheguttatus, XM_012979755.1)、番茄(Solanumlycopersicum, XM_004245347.4)、辣椒(Capsicumannuum, XM_016723913.1)、胡蘿卜(Daucuscarota, XM_017397194.1)和煙草(Nicotianatabacum, XM_016654878.1)的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并使用最大似然法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析StSTOMAGEN的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4StSTOMAGEN的亞細(xì)胞定位 將含有pCaMV35S-StSTOMAGEN-GFP表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和含P19沉默抑制基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌用注射緩沖液(10 mM MES，10 mM MgCl2和100 μM acetosyringone)稀釋到OD600=1，然后按照1∶1將二者混合后，注射到4周齡的煙草葉片中，每株注射3片葉片，每片葉片4個(gè)注射點(diǎn)，室溫暗處培養(yǎng)3 d后，通過(guò)生物激光共聚焦顯微鏡(Leica TCs SP2，488 nm，633 nm)觀察綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)，根據(jù)熒光的位置確定蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 將pCaMV35S-StSTOMAGEN-GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101后，利用浸花法[13]將該重組載體對(duì)擬南芥Col-0進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株(稱為ST)，收獲浸染后的T0代種子，消毒后再播種于含有25 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)后，根部正常延伸且葉片保持綠色的即可初步認(rèn)定為篩選的T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，移栽至土壤中進(jìn)一步生長(zhǎng)，收獲T2代種子。在1/2 MS篩選培養(yǎng)基(含25 μg·mL-1潮霉素)繼續(xù)篩選，可獲得純合株。最后分別進(jìn)行DNA水平(基因組DNA的PCR)和RNA水平(qRT-PCR)鑒定，確定T-DNA成功插入擬南芥基因組并且StSTOMAGFEN基因在擬南芥中得到表達(dá)。

1.2.6 氣孔密度的觀察 分別取生長(zhǎng)30 d的ST和WT擬南芥幼苗同一葉位、長(zhǎng)勢(shì)健康的葉片，根據(jù)Sugano等[12]的方法，首先用固定液(無(wú)水乙醇∶乙酸=9∶1)對(duì)葉片固定7 h以上，然后用脫色液(水合氯醛溶液∶水∶甘油=8∶2∶1)進(jìn)行脫色，最后用1 μg·mL-1番紅染色，在奧林巴斯BX51電子顯微鏡(Olympus America Inc., Melville, NY, USA)下觀察氣孔數(shù)目。每片蓮座葉上表皮選取4～6個(gè)視野進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)目，計(jì)算氣孔密度(個(gè)·mm-2)，每組重復(fù)3次。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的光合指標(biāo)測(cè)定 待ST和WT擬南芥生長(zhǎng)6周后，選取同一葉位的葉片用LiCOR 6800(Li-COR, Lincoln, NE, USA)便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)，在9∶00—12∶00進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)開(kāi)放式氣路，設(shè)定溫度為25℃，CO2濃度為719.6 mg·m-3，空氣相對(duì)濕度為50%，光強(qiáng)梯度為1 000、800、600，400、300、250、200、150、100、50 μmol·m-2·s-1和0 μmol·m-2·s-1PAR，間隔2～3 min的條件下測(cè)定葉片在每一光強(qiáng)下的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)和蒸騰速率(Tr)。同時(shí)使用FluorPen FP 100(PSI, Drasov, Czech Republic)測(cè)定Fv/Fm，即PSⅡ最大光量子產(chǎn)量。

1.2.8 葉片相對(duì)含水量的測(cè)定 對(duì)于對(duì)照和干旱處理的擬南芥，采用烘干稱量法測(cè)定葉片相對(duì)含水量。每組處理采集5片新鮮的完全展開(kāi)葉，迅速測(cè)定其鮮重(FW)，然后將葉片浸入去離子水中，放置24 h后稱其飽和鮮重(SW)，之后將葉片置于烘干箱內(nèi)烘至恒量，稱其干重(DW)，采用以下公式計(jì)算葉片相對(duì)含水量：

1.2.9 離體葉片水分散失速率測(cè)定 摘取生長(zhǎng)6周的WT和ST植株的相同葉位的成熟葉片，置于25℃環(huán)境下，自然風(fēng)干2 h。每10 min測(cè)1次樣品重量，重復(fù)3次。葉片失水率=(鮮重-風(fēng)干后重量)/鮮重×100%。

1.2.10 葉面積測(cè)定 為了測(cè)定不同株系擬南芥的葉面積，將正常供水與干旱處理后采的新鮮葉片用掃描儀Epson Perfection V700 Photo scanner(Seiko Epson Corporation，Beijing，China)掃描后，用WinRRHIZO PRO 2009軟件(Regent Inc.，Quebec，Canada)對(duì)其葉面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)株系重復(fù)3次。

1.2.11 開(kāi)花時(shí)間測(cè)定 參照Z(yǔ)hai等[14]的方法，將移栽后的擬南芥放于光照培養(yǎng)箱，按1.1中的條件正常光照培養(yǎng)生長(zhǎng)，等擬南芥抽薹1 cm后，統(tǒng)計(jì)蓮座葉葉片數(shù)，用葉片數(shù)衡量開(kāi)花時(shí)間。

1.2.12StSTOMAGEN過(guò)表達(dá)擬南芥的抗旱性分析 用干旱法[15]測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性。分別將正常生長(zhǎng)6周的ST和WT擬南芥干旱處理7 d后，然后復(fù)水2 d。在干旱處理5 d后觀察植株的抗旱表型并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的存活率并拍照，同時(shí)測(cè)量WT與ST擬南芥的地上部生物量、H2O2含量、相對(duì)含水量(RWC)、水分利用效率(iWUE)和其他氣體交換參數(shù)。

1.2.13 DAB染色 取WT 和ST擬南芥同一葉位成熟葉片在自然條件下，風(fēng)干1 h后，使用DAB(3,3’-diaminobenzidine-HCl)染色。然后抽真空2 min，去除染色液，加入適量的脫色液(無(wú)水乙醇)于60℃烘箱中進(jìn)行脫色。

1.2.14 H2O2含量測(cè)定 參照過(guò)氧化氫含量測(cè)定試劑盒(Solarbio，Beijing，China)說(shuō)明書(shū)測(cè)定WT和ST轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的過(guò)氧化氫含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.15 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010處理，用 SPSS17. 0(version 17.0; SPSS, Chicago, IL, USA)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和Duncan顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 StSTOMAGEN基因的克隆及進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)Joint Genome Institute Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(www.phytozome.com)，利用基于同源性的BLAST搜索(DOE JGI，Walnut Creek，CA，USA)從馬鈴薯中分離出StSTOMAGEN基因的cDNA，其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為288 bp，編碼含96個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。利用MEGA 6.0軟件將StSTOMAGEN的氨基酸序列與其他15個(gè)物種的蛋白序列進(jìn)行分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖1A)，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StSTOMAGEN與番茄SlSTOMAGEN親緣關(guān)系最近，同源性最高。通過(guò)比較StSTOMAGEN和AtSTOMAGEN的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，StSTOMAGEN在N端含有信號(hào)肽序列，在C端含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖 1B)，這表明StSTOMAGEN基因在功能上存在潛在的保守性。

2.2 StSTOMAGEN基因的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步驗(yàn)證StSTOMAGEN的組織表達(dá)模式，通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)StSTOMAGEN基因在馬鈴薯不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，StSTOMAGEN基因主要在葉片中表達(dá)，在頂端未展開(kāi)葉中的表達(dá)量最高，約是塊莖的200倍(圖 2A)。同時(shí)，StSTOMAGEN基因的表達(dá)量會(huì)隨著葉位的下降而下降，在新葉中表達(dá)量較高，而在底部老葉中的表達(dá)量較低。

此外，為了研究StSTOMAGEN在細(xì)胞中的表達(dá)位置，將StSTOMAGEN-FP 融合表達(dá)載體注射到煙草葉片，用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，StSTOMAGEN-GFP融合蛋白的熒光均勻分布于細(xì)胞間隙和細(xì)胞核，因此可以推測(cè)StSTOMAGEN基因編碼的蛋白主要定位在植物的細(xì)胞間隙和細(xì)胞核(圖 2B)。

隨后，對(duì)馬鈴薯植株進(jìn)行不同的非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，該基因的表達(dá)量在一天中呈現(xiàn)周期性變化，長(zhǎng)日照條件下(16 h/8 h，光/暗)，在授時(shí)因子為 20 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。PEG模擬干旱脅迫處理后，其表達(dá)量在4 h時(shí)達(dá)到峰值，ABA和NaCl脅迫處理后，其表達(dá)水平呈現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢(shì)(圖 3)。

2.3 過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN基因擬南芥的分子鑒定

通過(guò)浸花法將含有StSTOMAGEN基因過(guò)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選，獲得8個(gè)T3代純合株系，以野生型擬南芥為對(duì)照，對(duì)ST轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4A所示，在8株轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組內(nèi)均檢測(cè)到目的片段，而在WT擬南芥中沒(méi)有檢測(cè)到，說(shuō)明StSTOMAGEN基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組。qRT-PCR結(jié)果如圖4B，結(jié)果表明，8個(gè)ST株系的StSTOMAGEN表達(dá)水平都顯著升高。選取表達(dá)量較高的ST 7-3和ST 26-6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。通過(guò)觀察氣孔密度發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)株系葉片的氣孔密度顯著增大(圖4C和5B)，相對(duì)于WT，分別增加了83.4%和57.2%(圖4C)，同時(shí)，地上部生物量也顯著增大(圖5A和C)。此外，WT與ST擬南芥的開(kāi)花時(shí)間(圖4D)和葉面積(圖5D)沒(méi)有顯著差異，開(kāi)花時(shí)蓮座葉的數(shù)目都為10片左右。

注：(A)StSTOMAGEN蛋白與其他15個(gè)不同物種StSTOMAGEN蛋白的進(jìn)化分析。(B)馬鈴薯StSTOMAGEN和AtSTOMAGEN氨基酸序列比較。黑色陰影表示相同的氨基酸殘基，灰色陰影表示相似的氨基酸殘基，C表示保守的半胱氨酸殘基。Note:(A) Phylogenetic analysis of the StSTOMAGEN protein in 15 plant species. (B) Comparison of StSTOMAGEN and AtSTOMAGEN amino acid sequences. Identical and similar amino acid residues are shaded in black and gray, respectively. C is conservative cysteine residue.圖1 StSTOMAGEN蛋白的進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the deduced StSTOMAGEN amino acid sequence

注：(A)StEPF1-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位，比例尺為50μm；(B)StESTOMAGEN基因在不同組織的表達(dá)分析，包括：ST,莖尖；UE,頂端未展開(kāi)葉；L1，第一葉；L4，第四葉；L10，第10葉；S1，第1～3莖段；S2，第4～6莖段；S3,第7～9莖段；R,根；SS,塊莖；用Stef1α作為內(nèi)參基因。Note: (A)Subcellular localization of the StSTOMAGEN-GFP fusion protein. Scale bars: 50 μm; (B) Expression analysis of the StSOMAGEN gene in various tissues of 2-month-old potato plants including stem tip (ST); apical unexpanded leaf (UE); 1st, 4th, and 10th leaf (L) from the top; 1st～3rd, 4th～6th, and 7th～9th stem internode (S); root (R); and storage tuber (SS), Stef1α was used as an internal control for data normalization.圖2 馬鈴薯StSTOMAGEN基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)特征Fig.2 Molecular characterization of the StSTOMAGEN gene and the corresponding protein in potato

注：對(duì)照，正常生長(zhǎng)條件；PEG，5%的聚乙二醇(PEG6000)溶液；NaCl，100 mMNaCl溶液；ABA，50 μm 脫落酸溶液，用Stef1α作為內(nèi)參基因。Note: Control, normal growth condition; PEG, 5% polyethylene glycol (PEG6000); NaCl, 100 mM sodium chloride; ABA， 50 μM abscisic acid, Stef1α was used as an internal control for data normalization.圖3 StSTOMAGEN基因在多種逆境下的表達(dá)情況Fig.3 Temporal expression analysis of the StSTOMAGEN genein mature leaves of potato plants under abiotic stress conditions

2.4 StSTOMAGEN轉(zhuǎn)基因擬南芥光響應(yīng)曲線測(cè)定

由圖6A可知，當(dāng)光照強(qiáng)度低于250 μmol·m-2·s-1時(shí)，3個(gè)株系擬南芥的凈光合速率(Pn)隨光強(qiáng)呈線性增加且轉(zhuǎn)基因系顯著高于WT；當(dāng)光合有效輻射達(dá)到300 μmol·m-2·s-1及以上時(shí)，Pn保持平緩增加，當(dāng)光照強(qiáng)度高于800 μmol·m-2·s-1時(shí)，轉(zhuǎn)基因系和WT擬南芥的Pn都保持平緩，說(shuō)明Pn已經(jīng)達(dá)到最大值。此外，在不同光照條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的氣孔導(dǎo)度(gs)都顯著高于野生型。以上結(jié)果表明，氣孔密度對(duì)光合作用的光響應(yīng)產(chǎn)生顯著影響，隨著氣孔密度增大，植物的光合能力隨之增強(qiáng)。

2.5 過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN基因提高擬南芥對(duì)干旱的敏感性

對(duì)獲得的StSTOMAGEN轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱處理，7 d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出大量萎蔫死亡，而WT生長(zhǎng)狀態(tài)較好(圖7A)。干旱處理后，ST

注：*，P<0.05; **, P<0.01; Duncan顯著性檢驗(yàn)。下同。Note: *，P<0.05; **, P<0.01; Duncan significance test. The same below.圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定及氣孔密度分析Fig.4 Identification and stomatal density analysis of transgenic Arabidopsis

注：(A)WT與ST轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表型觀察；(B)WT與ST轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的氣孔密度觀察。Note: (A) Phenotype of wild-type (WT; Col-0) and StSTOMAGEN overexpression (ST) lines after 1 month of growth in pots. (B) Photos of mature abaxial leaf epidermis of 30-day-old WT and ST plants. Scale bars: 40 μm.圖5 過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN基因擬南芥的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis plants overexpressing StSTOMAGEN

圖6 不同光照強(qiáng)度下WT和ST擬南芥成熟葉片的光響應(yīng)曲線(A)和氣孔導(dǎo)度響應(yīng)曲線(B)Fig.6 Photosynthetic response (A) and stomatal conductance (B) curres of mature leavesof WT and ST plants under different light intensities

植株的地上部生物量、RWC、Fv/Fm、Pn、gs和iWUE都顯著降低(圖7B-G)。復(fù)水處理2天后，WT植株的存活率顯著高于ST(圖7A)。此外，ST植株的水分散失速率也顯著高于WT植株(圖8A)。葉片經(jīng)過(guò)1 h的水分散失后，通過(guò)DAB染色發(fā)現(xiàn)，ST株系葉片的H2O2含量也顯著高于于WT(圖8B和C)。以上結(jié)果表明，StSTOMAGEN在擬南芥中過(guò)量表達(dá)會(huì)降低擬南芥的抗旱性。

注：*：P<0.05,**：P<0.01，Duncan顯著性檢驗(yàn)。Note: *P< 0.05, **P< 0.01 by Duncan significance test.圖7 干旱處理對(duì)WT和ST擬南芥生長(zhǎng)的影響Fig.7 Influence of drought stress on WT and ST plants

圖8 WT與ST擬南芥植株的水分散失(A)和過(guò)氧化氫含量(B、C)Fig.8 Water loss (A) and hydrogen peroxide content (B,C) of WT and ST Arabidopsis plants

3 討 論

全球氣候的不斷變化使植物的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)峻的威脅[16]。為了應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的陸生環(huán)境，植物進(jìn)化出了氣孔，它是連接植物光合系統(tǒng)和大氣環(huán)境的通道[17]。氣孔的發(fā)育過(guò)程涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞不對(duì)稱分裂等重要的發(fā)育調(diào)控事件[18]。前人研究表明，在擬南芥中過(guò)表達(dá)氣孔密度表皮模式因子AtSTOMAGEN會(huì)增大擬南芥的氣孔密度，同時(shí)植物的光合能力也顯著提高[12,19]。本研究從馬鈴薯中克隆得到StSTOMAGEN基因，并對(duì)其在調(diào)控氣孔發(fā)育和調(diào)節(jié)擬南芥抗旱性中的作用進(jìn)行研究。

AtSTOMAGEN是擬南芥表皮模式因子(EPIDERMAL PATTERNING FACTOR，EPF)家族的成員，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)正調(diào)控氣孔密度的表皮模式因子[19]。前人研究表明，AtSTOMAGEN主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性代替表皮模式因子2(EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2，EPF2)與ER受體結(jié)合，抑制后者引起下游MAPK組分磷酸化，從而促進(jìn)氣孔發(fā)育[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)StSTOMAGEN主要定位于細(xì)胞間隙和細(xì)胞核，其表達(dá)模式具有組織特異性，主要在嫩葉中表達(dá)，這與氣孔主要分布在莖、葉等器官表皮的現(xiàn)象一致[21]。光合組織可能是通過(guò)其調(diào)節(jié)表皮氣孔密度，優(yōu)化CO2的吸收，提高光合效率[12]。此外，通過(guò)與AtSTOMAGEN的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，StSTOMAGEN在N端含有信號(hào)肽序列，C段含有相對(duì)保守的6個(gè)半胱氨酸殘基。過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN基因的擬南芥氣孔密度顯著增大，這與AtSTOMAGEN在調(diào)控?cái)M南芥氣孔密度中的作用一致[18]，說(shuō)明StSTOMAGEN在進(jìn)化過(guò)程中功能保守。

光響應(yīng)曲線是以光合產(chǎn)量或相對(duì)電子傳遞速率為一軸，而以PPFD或PAR為另一軸作圖得到，可以測(cè)量葉片適應(yīng)不同水平光照的能力以及葉片的最大凈光合速率[22]。前人通過(guò)研究擬南芥syp121氣孔開(kāi)度突變體發(fā)現(xiàn)，盡管突變體的氣孔開(kāi)度降低，但是只有在高光條件下植株的CO2同化速率和氣孔導(dǎo)度才會(huì)降低[23]。在本試驗(yàn)中，我們通過(guò)測(cè)定ST和WT擬南芥的光響應(yīng)曲線發(fā)現(xiàn)，氣孔密度對(duì)光合速率具有積極作用，3個(gè)株系的光合作用隨著光強(qiáng)的增加呈上升趨勢(shì)且ST擬南芥的光合速率顯著高于WT，但是氣孔導(dǎo)度隨光照變化不明顯。這與之前的報(bào)道是一致的，由干旱脅迫造成的氣孔導(dǎo)度降低僅在高光強(qiáng)下影響植物的光合作用[24]。

干旱脅迫會(huì)使植物的生長(zhǎng)受到抑制、光合速率降低，體內(nèi)積累大量活性氧，甚至導(dǎo)致植物死亡[25]。為了研究StSTOMAGEN在植物響應(yīng)干旱脅迫中的作用，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱處理并觀察表型，結(jié)果顯示，干旱處理7 d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥大量萎蔫甚至死亡，而野生型狀態(tài)較好。進(jìn)一步分析顯示，干旱處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部生物量、相對(duì)含水量、瞬時(shí)水分利用效率、二氧化碳同化速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率都顯著降低，說(shuō)明在擬南芥中過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN會(huì)降低植株對(duì)干旱脅迫的抗性。同時(shí)，利用擬南芥葉片測(cè)定水分散失速率，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的水分散失速率顯著高于野生型，表明轉(zhuǎn)基因系通過(guò)提高葉片失水速率增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的敏感性。綜上，轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下生長(zhǎng)受到抑制可能與組織水分狀況有關(guān)[26]，因?yàn)镾T株系葉片氣孔密度增大，會(huì)造成更多水分散失，從而使植物在受到嚴(yán)重脅迫的情況下，葉片水勢(shì)迅速降低，因此在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系無(wú)法保存葉片內(nèi)的可用水分，從而表現(xiàn)出明顯的枯黃萎蔫表型。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)StSTOMAGEN進(jìn)行干旱脅迫分析發(fā)現(xiàn)，該基因能被PEG誘導(dǎo)表達(dá)；將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因材料葉片中的氣孔數(shù)量顯著增多且光合速率顯著增強(qiáng)；對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和WT進(jìn)行干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料的抗旱性降低。上述結(jié)果表明，StSTOMAGEN是氣孔密度正調(diào)控因子，過(guò)表達(dá)StSTOMAGEN可提高擬南芥葉片的氣孔密度而降低擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性。本研究初步揭示了StSTOMAGEN基因與氣孔密度和干旱應(yīng)答的關(guān)系，為進(jìn)一步深入探討其分子機(jī)制提供理論依據(jù)。