2019年夏季成都市病死豬繁殖與呼吸綜合征感染情況分析

黃迪，李敏，周瀟瀟，周紫峣，向曉雪，岳建國*

（1.四川省成都市動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，又稱豬藍耳病。我國農業農村部將該病列為二類動物傳染病［1］。其主要臨床癥狀如下：妊娠母豬發生流產、早產、產木乃伊胎和死胎等嚴重繁殖障礙，各年齡段豬發生呼吸障礙［2］。近年來臨床癥狀趨于復雜，且多表現為混合感染，加大了該病診斷的難度［3］。PRRS具有發病急、傳播快、流行廣、病死率高等特點，自上世紀90 年代傳入我國以來，至今仍未被清除，給我國生豬養殖業帶來了持續威脅。2019年6～9月，筆者采用熒光定量PCR方法對成都市三個無害化處理廠的237 份組織病料樣本進行PRRSV 核酸檢測，旨在了解成都市養殖場中PRRS的發病情況，以期為成都市PRRS流行病學調查和疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 樣品采集于成都市無害化處理廠，來源于成都市15 個市（區）縣，共抽檢采樣豬淋巴組織237份。

1.1.2 主要試劑 磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自北京世紀元亨生物技術有限公司；豬藍耳病病毒通用型單重熒光PCR檢測試劑盒，購自北京億森寶生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 取2 mL 無菌Lysing Matrix 組織研磨管，加入1 mL PBS 液，再加入適量淋巴組織樣品，置于FastPrep-24?5G 研磨儀，研磨30 s后取下研磨管，置于離心機8 000 r/min離心1 min，取上清保存于-20 ℃備用。

1.2.2 RNA抽提 參照磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，配合KingFisher DUO自動化提取儀器，執行Tian_KingFisher_Duo.bdz 程序進行DNA 抽提。程序執行完畢，取出DNA，用封口膜封好保存于-20 ℃備用。

1.2.3 反轉錄-聚合酶鏈式反應 從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應液（PRRSV-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振蕩混勻后，10 000 r/min離心10 s。

PCR 反應管內依次加入熒光PCR 反應液14 μL，酶混合物1 μL，處理后樣品或陰性對照（NTC）、陽性對照（PRRSV-PTC）5 μL，配制成20 μL 的qRT-PCR 反應體系，10 000 r/min 離心10 s。將各反應管放入實時熒光PCR儀器反應槽內，循環條件如下：

第一步：反轉錄，45 ℃10 min，1個循環；第二步：預變性，95 ℃10 min，1 個循環；第三步：PCR擴增，95 ℃15 s、60 ℃45 s，40 個循環。在60 ℃延伸時收集熒光信號，報告基團：FAM，淬滅基團：NONE。

1.3 結果判定 直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則依據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。

在試驗成立的條件下，Ct值≤35 的樣本為陽性，表明PRRSV 核酸陽性；Ct值顯示為“None”的樣本為陰性，表明PRRSV 核酸陰性；如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。

2 結果與分析

檢測結果見表1。共檢測病死豬淋巴組織樣本237 份，結果得出PRRSV 陽性樣本有10 份，陽性率為4.22%。

表1 2019年夏季成都市病死豬繁殖與呼吸綜合征qRT-PCR檢測結果

3 討論

3.1 藍耳病防控現狀及建議 由于PRRS 的高傳染性、高致病性，使得我國PRRS的防控形勢依然嚴峻。為有效控制PRRS，相應的生物安全措施必不可少。控制PRRS的核心環節是穩定種豬群［4］。鑒于PRRSV 具有高度變異、易重組、毒株類型復雜的特點，各養殖場戶應重視閉群環節。PRRSV 陽性豬場應淘汰陽性種豬，停止引種，堅持自繁自養；陽性和陰性豬群應做好隔離消毒；豬只引種和運輸要嚴格檢疫，防止病毒引入和擴散；提高人員生物安全意識，嚴格執行生物安全標準；保證圈舍干燥通風、溫度適宜，將感染風險降到最低。

防控PRRS 的另一核心環節則是合理、科學地使用疫苗。部分養殖場戶因疫苗選用不當、接種計劃制定不合理以及滅活苗、弱毒苗濫用，加速了PRRSV 毒力返強和毒株間重組，導致PRRS疫情仍有散發并有多發趨勢［5］，也為我國PRRS的防控和凈化帶來了較大難度。

3.2 藍耳病防控目標 為了進一步加強動物疫病防控工作，農業農村部、財政部曾聯合印發了《關于調整完善動物疫病防控支持政策的通知》，高致病性豬藍耳病暫不實施國家強制免疫政策。遵照通知要求，陰性養殖場戶應杜絕PRRS免疫接種；穩定感染的養殖場戶不建議進行免疫接種；不穩定感染養殖場戶，應先做好周邊區域的流行病學調查，明確當地流行毒株，排查生物安全隱患，進而選擇相應毒株的弱毒苗按照適當的免疫計劃進行免疫。免疫方式和時間，受生產者的目標影響，如果生產者的目標是實現場戶內PRRSV 凈化，則最終應停止PRRSV 疫苗的免疫［6］。

目前我國正處于非洲豬瘟等動物疫病防控的關鍵時期，各養殖場戶應重視生物安全防護，嚴格執行生物安全規程；相關部門應遵照農業農村部印發的《國家高致病性藍耳病防治指導意見（2017-2020年）》，嚴格落實免疫預防、檢測凈化、檢疫監管、應急處置、無害化處理等綜合防控措施，積極開展場群或區域凈化工作。成都地區力爭在2020 年底實現市內核心育種場達到凈化標準，其他養殖場戶達到穩定控制標準的防治目標。本研究結果對各區（市）縣養殖場戶的PRRS感染情況進行了摸底，為成都市PRRS 流行病學調查和疫情防控提供了科學參考。本研究僅對PRRSV進行了通用型單重熒光PCR檢測，如需進一步確定各養殖場戶的流行毒株（如經典PRRSV、HP-PRRSV），則應進一步對相關病原進行分子生物學檢測。

4 結論

本研究表明，2019 年夏季在成都市抽檢的237 份豬淋巴組織樣品中，仍有PRRSV 陽性檢出，綜合陽性率為4.22%，表明成都市各區（市）縣養殖場戶中仍散在藍耳病毒。