西昌地區豬源腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

曾梅，徐樹培，張敏，李思聰，王斌，吳讓忠

（1.四川省木里縣動物疫病預防控制中心，四川 木里 615899；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和動物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起人和動物腹瀉、敗血癥等多種癥狀［1］。大腸桿菌在藥物的選擇壓力下易產生耐藥性，并可通過菌毛將耐藥質粒傳遞給其他大腸桿菌，因而給大腸桿菌病的藥物防控帶來了較大的挑戰［2］。當前大腸桿菌耐藥及多重耐藥現象日益嚴重，動物源耐藥菌株可能會通過環境污染、動物源食品及與動物的接觸傳播給人類，導致公共衛生問題。本研究對四川西昌地區豬源樣品進行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，以期為合理使用抗生素提供依據。

1 材料

1.1 樣本采集 無菌采集西昌地區21個豬場的病死豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結作為病料樣本，置滅菌普通肉湯離心管中，送實驗室進行細菌分離。

1.2 試劑、培養基和標準菌株 麥康凱瓊脂、營養肉湯、MH瓊脂、普通營養瓊脂、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑公司；標準菌株：大腸桿菌標準株ATCC 25922，購自中國獸藥監察所。

1.3 實驗動物 昆明系SPF小鼠，購自四川達碩生物技術有限公司。

2 方法

2.1 病料接種 無菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養基中，37 ℃下進行24 h 增菌培養。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上，37 ℃純化培養24 h。

2.2 菌落形態特征觀察 伊紅美藍瓊脂上出現黑棕色、棕綠色且帶有金屬反光的菌落，或出現中心黑點邊緣呈灰白色的表面光滑的菌落；麥康凱瓊脂上出現典型紅色、粉紅色的光滑菌落。采用16s rDNA PCR作進一步的分子鑒定。

2.3 16S rDNA PCR 測序鑒定［3］從伊紅美藍瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個菌落進行PCR 試驗，擴增細菌16S rDNA 基因。引物為通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應條件：95℃5min；95℃1min；50 ℃1min，72 ℃2 min，共30 次循環；72 ℃延伸8 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預擴增片段1 450 bp。PCR 產物由上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序，序列結果用NCBI BLAST 搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性試驗［4］將鑒定了的豬源大腸桿菌接種到MH 瓊脂平板，經37 ℃24 h 純培養，用滅菌生理鹽水洗下菌液，調整渾濁度與0.5 麥氏比濁管（1×108CFU/mL）相當，再分別腹腔注射小白鼠（0.2 mL/只），每株菌同時接種3只小鼠，并設標準株ATCC 25922 為對照，觀察分離菌株對小鼠的致病性。

2.5 藥敏試驗 菌株于MH 肉湯中恒溫（37 ℃）培養12 h后，用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度，均勻涂布于MH瓊脂平板。然后用藥敏紙片分散器將藥敏紙片均勻貼在瓊脂平板表面，37 ℃恒溫培養18 h后測量抑菌圈大小。

3 結果

3.1 細菌分離 從21 個豬場采集的106 份病料樣本中分離到大腸桿菌28 株，分離率達26.4%。各個臟器的分離率分別為心臟7.1%（2/28），肺臟32.1%（9/28），淋巴結21.4%（6/28），肝臟7.1%（2/28），脾臟10.7%（3/28），腎臟21.4%（6/28）。

3.2 致病性試驗 用分離出來的28株大腸桿菌攻毒小鼠，24 h內有6株導致1只小鼠死亡，14株導致2只小鼠死亡，8株導致3只小鼠死亡。從死亡小鼠的器官中也分離到了同種菌。對照組無死亡。

3.3 藥敏試驗 28 株大腸桿菌的藥敏試驗結果見表1。從表1 可知，本次臨床分離菌對阿莫西林、氨芐西林、強力霉素、四環素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥性嚴重，耐藥率高于85%，對阿米卡星和頭孢喹肟保持較高的敏感性，耐藥率分別為14.3%和10.7%。28株大腸桿菌全部表現為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，表明西昌地區豬源腸外致病性大腸桿菌的耐藥性強、耐藥譜廣。

表1 28株大腸桿菌分離株的耐藥性檢測

4 討論

4.1 本試驗對西昌地區豬源大腸桿菌的耐藥情況進行了檢測分析。結果表明，所分離的28株大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、強力霉素、四環素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥率高于85%。28株大腸桿菌全部表現為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，表明西昌地區豬源腸外致病性大腸桿菌的耐藥性強、耐藥譜廣。

4.2 檢測結果顯示28株耐藥大腸桿菌對頭孢喹肟、阿米卡星敏感性較高，與2017年孔令漢等［5］、2015 年王斌等［6］報道的結果一致。阿米卡星耐藥率低的主要原因可能與阿米卡星作為人醫臨床用藥尚未允許在獸醫臨床使用有關，但值得關注的是，分離菌株中仍有14.3%對阿米卡星耐藥，其耐藥機制值得進一步研究。頭孢喹肟為第四代動物專用頭孢菌素，在我國獸醫臨床上的使用時間較短，故對分離菌具有較好的抑菌效果。

4.3 β-內酰胺類抗生素作為獸醫和人醫常用抗生素，其耐藥性的發生發展不僅關系到畜禽健康養殖，而且對人醫臨床上的耐藥性檢測具有重要的參考價值。本試驗分離的西昌地區21 個養殖場的28 株豬源大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林的耐藥性高達90%以上，與王斌等［6］、曾博等［7］研究的結果相似。2013 年曾博等［7］曾報道其分離的79 株規模化豬場腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）對氨芐西林（耐藥率為87.3%）、阿莫西林（耐藥率為91.1%）的耐藥性較強，對頭孢噻呋（耐藥率為7.6%）、氨芐西林/舒巴坦（耐藥率為11.4%）、阿莫西林/棒酸（耐藥率為16.4%）相對敏感。2015 年王斌等［6］報道其分離的40 株ExPEC菌株對氨芐西林（耐藥率為92.5%）的耐藥性較強，對氨芐西林/舒巴坦（耐藥率為12.5%）、頭孢克肟（耐藥率為10.0%）表現出相對較好的敏感性。值得關注的是，近年來復方β-內酰胺酶抑制劑類抗生素和頭孢類抗生素的耐藥性有增加趨勢，可能與這兩類藥物在臨床中大量使用有關［8］。建議養殖戶加強生豬養殖過程中的生物安全管理，通過藥敏試驗篩選敏感藥物，做到精準用藥、科學用藥。