硅珠法提取DNA的靈敏度及抗抑制能力探究*

趙凱 林大鈞 盧俊 于瑞國 黃梓輝

1.廣東省公安廳刑事技術中心2.廣東省湛江市公安局

3.中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院4.高盛生物技術股份有限公司

引言

得益于容易實現自動化提取的優勢，磁珠法作為目前主流的核酸DNA提取手段，在法醫鑒定領域得到了非常廣泛的應用。但在此趨勢下，不易實現自動化的硅珠法仍然沒有被市場淘汰，就是因為硅珠法具有磁珠法所不具備的優勢。與磁珠相比，硅珠法提取在靈敏度方面并沒有明顯差異，而且硅珠法提取所得的產物更為純凈，適用于法醫上的疑難檢材提取，如陳舊骨骼、腐敗組織等[1,2]。由于法醫檢材的復雜性以及特殊性，在提取過程中會存在各種抑制物，如泥土、灰塵、油污等，大大增加了提取的難度。因此，核酸提取方法的抗抑制能力在法醫領域尤其重要。為驗證硅珠法提取DNA的靈敏度，并且探究該方法的抗抑制能力，本文設計方案，模擬法醫樣品進行測試，以期正確評價硅珠提取法的靈敏度及抗抑制性能。

一、材料與方法

（一）材料

實驗所用標準DNA為ABI公司VeriFilerTMPlus PCR擴增試劑盒中自帶的007標準DNA，濃度為100pg/ul；血液樣本用EDTA抗凝管采集混勻后分裝，-20℃凍存，使用前隨機取3管分裝的血液混合，充分混勻后用無菌超純水稀釋1000倍待用；硅珠提取以及磁珠提取分別采用一款常見市售試劑盒；提取產物的擴增使用VeriFilerTMPlus PCR試劑盒，并采用ABI公司Veriti 96 Well Fast Thermal Cycler型號擴增儀；電泳分析采用ABI公司3500型號測序儀。

（二）樣品處理

標準DNA混勻后直接吸取相應體積，添加至離心管上層套管待用；稀釋血液混勻后吸取相應體積，滴加至棉簽頭上，剪下棉簽頭，放置到離心管上層套管待用；抗抑制能力測試組，稀釋血如上所述處理好后，再添加抑制物至上層套管內，盡量混勻，待用。磁珠提取和硅珠提取的樣本處理方式保持一致，每個樣品設置3個重復。

（三）樣品提取

樣品準備好之后，硅珠提取和磁珠提取各自按說明書進行裂解、結合、清洗、烘干以及洗脫等步驟。磁珠提取最終轉移上清產物待用，硅珠提取則保留硅珠得到最終產物。

（四）STR擴增及電泳分析

擴增體系為2ul Mix+1ul Primer+7ul提取產物，總共進行29個循環。硅珠提取產物可帶珠擴增，因此吸取擴增模板前應充分混勻。擴增結束后使用ABI 3500測序儀進行電泳分析，體系為9.7ul HIDI+0.3ul Size Standard（LIZ 600）+1ul PCR product；電泳參數為電壓1.2kV，進樣時間18秒，進樣量1ul。

二、結果

（一）提取靈敏度對比

對于硅珠法提取靈敏度的驗證，實驗設置了樣品的濃度梯度進行測試：標準DNA 300pg、400pg、500pg；1000×稀釋血10ul、20ul、30ul；磁珠提取僅設置標準DNA 300pg、1000×稀釋血10ul進行測試。洗脫體積皆為50ul。結果如圖1A所示，當DNA投入量為300pg時，硅珠提取法平均可獲得23.7個位點，檢出率在95%以上，與磁珠提取效率相同（圖1B）；而當DNA投入量為500pg時，已經可以穩定檢出全位點（25個）。對于10ul稀釋血樣品（圖1 A），硅珠提取平均可檢出21.7個位點，與磁珠提取結果相同（圖1B），無顯著差異（表1）；當稀釋血量為30ul時，硅珠提取可穩定檢出全位點。通過STR圖譜分析，可知硅珠法在提取300pg DNA時，峰值范圍為300~1400 RFU（圖2A），相比磁珠法提取峰值范圍300~4000 RFU（圖2 B），在最高峰值上有所差異；在提取10ul稀釋血時，硅珠法峰值范圍為300~3500 RFU（圖2C），效果比磁珠法（峰值范圍200~1200 RFU）更優（圖2D）。

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（二）硅珠提取靈敏度優化方法

納米硅珠顆粒粒徑一般比磁珠顆粒小，且不帶磁核，對PCR擴增無抑制作用，因此可以帶珠擴增[6]。硅珠這一特性使小體積洗脫以提高靈敏度成為可能，這也是磁珠所不具備的優勢。在本實驗中，設置了標準DNA 100pg、1000×稀釋血5ul進行測試，洗脫體積分為10ul和20ul兩個梯度。結果顯示，用10ul體積洗脫時，100pg標準DNA平均可穩定檢出24個位點，5ul 1000×稀釋血平均可檢出23.7個位點，兩者位點檢出率皆在94.8%以上；20ul洗脫時，100pg標準DNA和5ul 1000×稀釋血皆平均可檢出21.3個位點（圖3A）。STR圖譜顯示，在10ul洗脫條件下，硅珠法提取100pg DNA的STR峰值范圍可達200~1800 RFU（圖3 B）；提取10ul稀釋血時峰值甚至可達400~2000 RFU（圖3C）。因此，通過減小洗脫體積并帶珠擴增的方式，硅珠法提取DNA的靈敏度可得到顯著提升（表2）。

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（三）模擬抗抑制能力測試

在真實案件中，檢材類別豐富多樣，經常會含有各種可能會對檢材DNA的提取和擴增帶來干擾的物質，因此提取方法的抗抑制能力尤其重要。本實驗根據日常案件常見檢材可能攜帶的抑制物，收集了包括鐵銹、灰塵、墻灰、牙膏、果汁、油脂、單寧酸在內的7種模擬抑制物，以500pg標準DNA以及30ul 1000×稀釋血為提取樣本，分別加入單倍量及雙倍量的抑制物進行測試，洗脫體積皆為50ul。模擬抑制物具體添加量見表3：牙膏事先均勻涂在濾紙上晾干，然后剪取適當大小紙片；果汁為人工榨取蘋果、橙汁混合，常溫放置1天；單寧酸事先配制成11mg/ml母液；油脂為植物油；其余材料采集自室內或室外。結果顯示，在單倍量抑制物存在時，單寧酸對標準DNA及血樣的結果都有較大影響，但是位點平均都在18個以上；其余抑制物則位點平均都在20個以上，對硅珠法提取的影響較小。在加倍量抑制物存在時，抑制效果比單倍量有所加強，但平均仍可獲得18個STR位點以上。由此可見，硅珠法提取DNA具有良好的抗抑制能力（表4）。

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三、討論

當檢材中所含有的人源細胞被充分裂解后，納米硅珠顆粒通過自身攜帶的硅羥基，在低pH、高鹽條件下與DNA互相結合，在高pH、低鹽條件下逆轉，釋放DNA[3,4]。這種提取原理簡單高效，可從各類復雜樣本中穩定獲得高純度的DNA，方便后續STR位點分析。通過本文的驗證和測試，證實了硅珠法具有媲美磁珠法的靈敏度。在50ul洗脫時，硅珠法可穩定檢出300pg標準DNA及20ul 1000×稀釋血。當洗脫體積減少至10~20ul時，甚至可有效檢出100pg標準DNA以及5ul 1000×稀釋血。在保證靈敏度的同時，硅珠法提取還具有良好的抗抑制能力。根據本實驗室以往測試及案件分析結果，本文所選取的7種模擬抑制物在日常真實案件中較為常見，且對磁珠法的提取效果皆有一定影響，而對于硅珠法提取的提取效果則影響較小。其中，單寧酸對硅珠法的影響相對較大，推測原因為單寧酸可與溶液中可溶性蛋白結合形成不溶性固體，高速離心時隨著硅珠一起沉淀，最終被帶到提取產物中，影響PCR擴增。另外，單寧酸可能存在于土壤或者皮革衣物中，一般含量較少，本文測試中所加的單寧酸量相對較大，因此增加了對結果的影響。

分析靈敏度測試結果發現，硅珠法提取標準DNA的效率高于提取稀釋血液的效率。血液成分復雜程度遠超純凈的標準DNA樣品，在提取穩定性上會受到一定程度的影響。另外，為模擬真實條件，血液樣本滴加在棉簽頭上進行裂解。在此過程中，棉纖維會牢固吸附部分DNA，使其被截留，且細微的棉纖維還會隨離心進入下層管，造成硅珠及磁珠的輕微聚團，降低了吸附以及洗脫效率，最終影響STR位點檢出率，這也是該類提取方法今后需要優化的方向之一。盡管如此，硅珠法在提取稀釋血方面仍具有優異的表現。

經過不斷的改良，硅珠法的提取效果已經得到顯著提升，在真實疑難案件中的應用也常有報道[5-7]。汗潛指紋中脫落細胞稀少，較難獲得完整STR分型，在雒彩虹等的研究中，硅珠法提取汗潛指紋等接觸性檢材效果優異[8,9]。而對于高度腐敗、污穢的案件檢材，硅珠法的表現也可圈可點，林大鈞等就通過該方法，成功從高度腐敗的肋軟骨組織、污水浸泡的鋼絲，以及污穢指甲垢中獲取了有效的STR分型結果[10-12]。這些研究都表明，硅珠法在面對超微量、高度污穢、腐敗等復雜檢材時，具有更高的抗抑制能力，并且得益于可帶珠擴增的特點，可以通過減小洗脫體積的方式，極大提高提取靈敏度。因此，硅珠法可作為磁珠法的重要補充，可更有效處理磁珠法提取無法檢出的檢材。綜上所述，硅珠法作為一種具備獨特優勢的提取方法，必將在未來得到更廣闊的應用。