基于激光拉曼光譜的石斛黃酒酒精快速檢測方法研究

張仲義

（皖西學院電信學院 安徽六安 237012）

一、引言

石斛黃酒因其具有豐富的營養價值與保健功能備受人們的關注，主要是因為石斛含有功能性多糖與微量元素[1]。為了提升石斛黃酒的營養價值與質量，廣大科研工作者一直致力于生產工藝方面的研究。曾麗萍等人通過正交試驗方法優化芽孢桿菌與釀酒酵母發酵石斛酒條件，研制出口感達到97.5分的石斛酒[2]。然而，酒精是反映黃酒發酵程度與質量的重要指標之一。趙梅等人發現黃酒前后發酵期酒精的濃度與氨基酸、總糖具有明顯的線性關系[3]。因此，黃酒廠家一般會通過監測黃酒的酒精濃度來判斷酒糟的發酵程度。Yu等人通過紅外光譜快速進行測定黃酒中酒精濃度，并建立了酒精與黃酒品質匹配的參數模型[4]。但是，由于紅外光譜檢測方法制樣比較復雜，容易受水吸收峰的干擾，無法滿足黃酒發酵過程快速檢測需求。

激光拉曼光譜是近些來用于復雜樣品無損分析的重要手段之一，能夠替代紅外光譜進行水樣微量分析。劉文涵等人建立了白酒類乙醇檢測的激光拉曼光譜法，檢出限達到1.02%[5]。然而，對于黃酒類復雜產品的拉曼光譜檢測方法鮮有報導。本文通過以拉曼位移880cm-1（-CCO伸縮振動）和1455cm-1（-CH2彎曲振動）作為特征峰，建立了檢測乙醇溶液濃度的激光拉曼光譜指紋圖譜。同時，以不同發酵程度的石斛黃酒為研究對象進行檢測與驗證，為推動速效監控黃酒質量技術提供重要的參考依據。

二、材料與方法

（一）儀器試劑。分析天平（BD61型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；微量分析型超純水機（ULUP-I型，四川優普超純科技有限公司）；臺式高速離心機（SIGMA1-14型，德國Sigma公司）；不銹鋼發酵罐（HF-S型，北京霍爾斯生物科技有限公司）；激光拉曼光譜儀（LRS2/3型，天津港東科技發展股份有限公司）：激發光源532nm，40mW；光柵1200L/mm；狹縫寬度0-2mm；示值精度0.01mm；物鏡倍數為50倍。

無水乙醇（AR，≥99.7%）購于國藥集團化學試劑有限公司；石斛及其它輔料購于本地超市；實驗所用水均為超純水。

（二）實驗方法。

1.乙醇標準液的測定。準確量取1、2、5、10、20mL乙醇，分別配置成濃度為1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液。分別移取各個濃度的乙醇溶液20μL，滴到拉曼光譜儀載玻片上，并使用激光拉曼光譜儀自帶的物鏡進行觀察，對焦進行光譜掃描測定。

2.石斛黃酒發酵試驗。稱取適量糯米，淘洗干凈后冷水浸泡12h，瀝干蒸煮至熟，冷卻后準確稱量1000g米飯移入發酵罐中，加入鐵皮石斛、活化后液態酵母、麥曲以及適量的水，混合均勻，控制溫度15-18℃，密封發酵20天。為了保證實驗的準確性設置3組平行試驗。

3.樣品采集。根據黃酒釀造經驗，其主發酵時間主要在5-7天，后發酵時間主要指10-20天。因此，為了讓取樣點分布均勻同時不影響發酵質量，樣品采集時間點分別設置為第2、5、7、15、20天。每組平行試驗各采集1個樣，合計15個樣品。收集到的樣品在4000r/min下離心5min，取上清液過濾，滴到拉曼光譜儀載玻片上，并使用激光拉曼光譜儀自帶的物鏡進行觀察，對焦進行光譜掃描測定。

4.數據采集與處理。本文使用origin 8.0對實驗數據進行統計與作圖，并使用軟件數據分析模塊進行均值化與標準差分析。

三、結果與討論

（一）不同濃度乙醇拉曼光譜。如圖1所示，分別為濃度1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液拉曼光譜圖。大部分特征峰主要集中在750cm-1-3000cm-1拉曼位移區域，其它區域拉曼峰主要是水溶劑背景的特征峰，例如拉曼位移3200cm-1附近的特征峰。其中拉曼位移880cm-1處最為明顯，主要是因為乙醇分子中的-CCO伸縮振動。此外，乙醇的拉曼光譜特征峰還包括拉曼位移 1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及2935cm-1處。盡管這些特征峰與前人研究的譜圖存在少許偏差，但基本保持在±2cm-1左右。其中，拉曼位移1085cm-1處為-CH3不對稱伸縮振動；拉曼位移1455cm-1和2880cm-1處為-CH2-與-CH3不對稱變形（彎曲）振動；拉曼位移2935cm-1處為-CH2-與-CH3不對稱伸縮振動。

圖1 不同濃度乙醇溶液拉曼譜圖

（a-e乙醇濃度：1%、2%、5%、10%、20%）

此外，考慮到溶劑背景以及樣品其它干擾組分的存在，本文選擇峰強度最高的拉曼位移880cm-1處作為定量峰。隨著乙醇濃度不斷增大，定量特征峰強度呈線性增大，所以拉曼位移880cm-1處特征峰強度能夠用于測定乙醇的含量。如表1所示，為定量峰峰強度與乙醇濃度數據匯總，通過origin軟件方差分析計算，得到乙醇濃度與拉曼位移880cm-1處特征峰強度相關系數r2=0.9915，線性回歸方程：Y=59.731x+26.048。通過回歸方程計算，加標后乙醇溶液回收率達到85.2%～108.6%。

表1 定量峰峰強度與乙醇濃度數據

（二）加標樣品拉曼光譜。根據設定的取樣規則，分別在第2、5、7、15、20天取樣并使用激光拉曼光譜檢測。如圖2所示，充分體現了石斛黃酒發酵制備不同階段乙醇濃度與時間變化的關系。在發酵過程中，在活性酵母與麥曲的催化作用下，糯米、石斛等碳水化合物不斷的轉化為乙醇。其中第0～7天為主發酵期，乙醇的濃度急劇增加，在第7天乙醇含量達到95g/L；在第7～20天為次發酵期，乙醇轉化的速度逐漸下降，最終含量逐漸趨于恒定（大約為110g/L）。

同時，不同發酵時間樣品的拉曼光譜圖顯示，隨著發酵時間的增加乙醇的拉曼光譜特征峰：拉曼位移880cm-1、1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及 2935cm-1處的峰強度均逐漸增大，說明乙醇產量在不斷增加。在主發酵期，拉曼位移1000cm-1-2000cm-1處存在較多干擾峰，可能由于主發酵過程中多糖、有機酸、淀粉等成分的影響導致出現峰強較弱的雜亂峰。但拉曼位移880cm-1處特征峰依然比較突出，不影響乙醇濃度的檢測。而在次發酵期，第10天與第20天的拉曼光譜譜圖中的特征峰型與數量基本一致，說明第10天基料碳水化合物以及基本全部轉化為乙醇，其他組分對于譜圖的干擾較小。

圖2 不同發酵時間樣品乙醇濃度變化

四、結論

隨著網絡科技的發展，促進了石斛黃酒產業的迅速復蘇與突破地域的局限性，加快我國功能性飲品行業的改革速度。但黃酒產品質量分析與監控技術的研究依舊是目前的大熱點。為遏制市場上售賣虛假石斛黃酒的現象，提升黃酒產品質量監控檢測技術，本文通過激光拉曼光譜技術建立快速檢測石斛黃酒生產過程中乙醇濃度的方法。不僅具有分析速度快、準確度高、回收率好等優點，還實現了無損、綠色的乙醇濃度定性、定量檢測，對石斛黃酒實際生產過程質量監測具有良好的應用價值。