CSF-ctDNA與TIF-ctDNA檢測在腦膠質瘤中的臨床應用研究*

禹金良 盛致遠 高玉帥 閆兆月 孫勇 步星耀

膠質瘤是顱內最常見的原發性惡性腫瘤，病死率高，易復發，經過外科精準手術聯合放、化療治療后效果仍不理想［1］。隨著近年腫瘤精準醫療的發展，腫瘤的治療逐漸進入個體化精準診療時代，根據不同分子表型制定特定的治療方案可提高治療效果使患者獲益。據報道［2］美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的許多分子靶向療法在多種惡性腫瘤（乳腺癌、白血病、結腸直腸癌、肺癌和卵巢癌）的治療中已有顯著的臨床療效。對膠質瘤進行精準個體化治療必須對其進行精準分子學分型。腫瘤發生和復發的過程，也是腫瘤基因組改變的動態過程［3］，大多數腫瘤在放、化療后會造成新的基因突變［4］，導致腫瘤耐藥，單次的組織分子病理信息不能代表腫瘤演變及基因組變化的過程，臨床上更需要能夠連續追蹤膠質瘤基因組改變更有價值的診斷方法。近年研究腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中發現了CSF-ctDNA，并可以追蹤膠質瘤的演變［5］，比來自血液循環的循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）更能代表腫瘤的基因改變［6］，而且相對腫瘤組織學基因檢測更全面、更有意義［7］。腫瘤間質液（tumor interstitial fluid，TIF）是浸潤腫瘤和基質細胞（包括免疫細胞）的組織間液，潛在的生物標志物將以高濃度局部出現在TIF中，并最終在CSF 中被稀釋，可靠地反映出局部腫瘤微環境TIF的使用，能夠鑒定可用于疾病的早期檢測和監測的物質［8］。目前國內外鮮見采用TIF-ctDNA檢測輔助實體腫瘤診療的研究。本研究采用二代基因測序（next generation sequencing，NGS）技術，探討CSF-ctDNA 與TIF-ctDNA 檢測在腦膠質瘤中的診斷、復發監測、腫瘤標志物及靶向藥物篩選等方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 入組標準 選取2019年1月至12月河南省人民醫院收治的12例膠質瘤患者。入組標準：年齡18～80歲，Karnofsky評分（KPS）≥60分；無肺、心、肝、腎等重要臟器功能障礙，血紅蛋白（HGB）≥100 g/L，白細胞計數（WBC）＞4×109/L，血小板計數（PLT）≥100×109/L；術后腫瘤全切，病理結果證實為腦膠質瘤；術后無顱內血腫、顱內感染等嚴重并發癥；在本院接受替莫唑胺口服聯合瘤腔局部化療、術中置入Ommaya儲液囊的患者。排除標準：曾接受血管表皮生長因子等靶向治療；原發灶術前曾接受過化療或免疫治療；曾患其他系統惡性腫瘤。本研究獲得患者知情同意，并簽署書面知情同意書，且經過本院倫理委員會批準。

1.1.2 病例特征 本研究共收集12例腦膠質瘤患者的CSF與TIF配對標本。其中男性4例，女性8例；年齡15～65歲，平均年齡（48.1±13.9）歲。根據WHO中樞神經系統腫瘤分類，膠質母細胞瘤（WHOⅣ級）7例（58.3%），少突星形細胞瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%），間變星形細胞瘤（WHOⅢ級）1例（8.3%），間變少突細胞瘤（WHOⅢ級）1例（8.3%），星形細胞瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%），室管膜瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%）。根據檢測結果，1例少突星形細胞瘤與1例間變星形細胞瘤未在CSF中未發現ctDNA突變，1例室管膜瘤在對應標本中未檢測到CSFctDNA與TIF-ctDNA陽性突變，其他患者均在對應標本中檢測到ctDNA突變。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 術中采用多模態影像融合神經導航和功能定位檢測技術，最大范圍安全切除腫瘤組織，將Ommaya 儲液囊植入，連接管端放置腫瘤殘腔中，儲液囊端固定于帽狀腱膜下。依據中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南（2015 版），對于低級別膠質瘤術后采用放療（高危患者）聯合替莫唑胺同步和輔助化療；高級別膠質瘤在標準的STUPP 治療方案基礎上，瘤腔局部化療。

1.2.2 標本獲取 手術結束3 個月后開始收集患者CSF與TIF標本，于當月次化療周期開始前1天收集，同時取患者CSF 標本8.0～12.0 mL、TIF 標本0.5～1.0 mL、血液標本5.0 mL，并存入-80°冰箱。血液標本取自周圍靜脈血。CSF 標本通過腰穿獲取（圖1）。TIF 標本獲取（圖2）操作步驟：剔除Ommaya 儲液囊周圍毛發，酒精紗布擦拭儲液囊周圍，除去油脂等雜質，碘伏消毒3 遍，消毒范圍為儲液囊周圍3.0～5.0 cm；戴無菌手套固定穿刺點，用1.0 mL 注射器經皮穿刺Ommaya儲液囊，緩慢抽出儲液囊內或腫瘤殘腔的液體0.5～1.0 mL，抽針，棉球按壓止血2 min。

1.2.3 ctDNA的提取 所有臨床收集的CSF樣本、TIF樣本及血液樣本均使用NGS技術進行檢測，CSF、TIF測序深度為20 000X，對照血液白細胞測序深度為250X。樣本在EDTA管中用13 000 r/min離心機，離心10 min，沉淀顆粒-80℃凍存。而上清則以12 000 r/min離心機，離心10 min，TIF測序深度為20 000X，轉移至超低溫管-80℃保存。上清液采用MagMAXTMCellFree DNA分離試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）提取cfDNA（cellfree DNA）。最后使用Qubit dsDNA HS分析試劑盒（Life Technologies，美國），Qubit 2.0熒光儀對所有分離的DNA進行量化分析。

1.2.4 基因文庫的構建及測序 利用Covaris M220聚焦超聲檢測儀（Covaris，美國）將基因組DNA 剪切成150～200 bp 片段，采用KAPA Hyper 文庫準備試劑盒（KK8504，Illumina 平臺，美國）對ctDNA 進行文庫構建，連接可供測序儀識別的接頭序列，以及用于區分于不同樣本的標簽序列；使用SureSelectQXT Re?agent試劑盒（G96838，美國）進行文庫的捕獲，并富集目的片段，得到足量的測序文庫，進行qRCR（實時熒光定量核酸擴增檢測系統）檢測確定有效濃度，按照測序數量比例混合為1 個pooling 文庫運用NovaSeq 6000 S4 Reagent 試劑盒（300 cycles，Illumina 平臺，美國）上機測序，獲得下機數據進行生物信息學分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。使用秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

圖1 采用腰穿收集腦膠質瘤患者的CSF標本

圖2 經皮Ommaya儲液囊穿刺獲取患者的TIF標本

2 結果

2.1 基因檢測結果

12例膠質瘤患者中共檢測到57種不同類別的變異基因共209 個，樣本總平均突變數為8.7 個，CSFctDNA 平均突變數為4.3 個，TIF-ctDNA 平均突變數為13 個。CSF-ctDNA 樣本中3 例未檢測出陽性結果，陽性率為75.0%（9 例）；TIF-ctDNA 樣本中1 例未檢測出陽性結果，陽性率為91.6%（11 例）。TIF-ctD?NA中共檢測到55種類型的基因突變，其中改變最頻繁的基因TP53 5 例（41.6%），SETD2 5 例（41.6%），EGFR 4 例（33.3%），FAT1 4 例（33.3%），RELA 4 例（33.3%），DAXX 4 例（33.3%），IDH1 4 例（33.3%）。CSF-ctDNA 中檢測到25 種類型的基因突變，其中改變最頻繁的基因為TP53 5 例（41.6%），SETD2 5 例（41.6%），FAT1 4例（33.3%），EGFR 3例（25.0%），RE?LA 3 例（25.0%），IDH1 3 例（25.0%），NF1 3 例（25.0%），PTEN 3 例（25.0%）。兩種方式均檢測到膠質瘤中一些常見的基因突變，如KRAS、TP53、EGFR、IDH、ATRX、PTEN，均為膠質瘤的潛在腫瘤標志物。檢測出IDH1突變的4個樣本分別來自間變星形細胞瘤、間變少突細胞瘤、星形細胞瘤與高級別膠質瘤患者各1例。TP53突變的5個樣本分別來自3例膠質母細胞瘤、間變少突細胞瘤與星形細胞瘤患者。檢測出SETD2突變的5個樣本來自4例膠質母細胞瘤與1例星形細胞瘤患者。EGFR突變的4個樣本來自3例膠質母細胞瘤與1例星形細胞瘤患者。ATRX突變來自膠質母細胞瘤、間變少突細胞瘤與星形細胞瘤患者各1 例。BRAF 變異來自1 例膠質母細胞瘤患者。患者CSF與TIF樣本基因突變頻數見圖3。

圖3 12例膠質瘤患者的基因突變數

2.2 復發與生物信息學分析

本研究中5 例患者在檢測后2～4 個月內影像學發現不同程度的腫瘤復發，患者ctDNA 檢測發現TP53、EGFR 或SETD2 基因突變，較影像學發現復發時間平均提前2.9個月（圖4）。經過生物信息學分析在57 種不同類別的基因變異中，突變基因PIK3CA、PTEN、KRAS、EGFR、TP53、NF1、BRCA1、BRCA2、TSC1、TSC2、IDH1、CDKN2A 匹配到靶向潛在獲益藥物，突變基因PIK3CA、KRAS、EGFR 匹配到潛在耐藥藥物（表1）。

圖4 5例膠質瘤患者影像學表現

表1 突變基因靶向藥物

2.3 標本ctDNA濃度

本研究CSF 與TIF 標本中，ctDNA 濃度有較大差異。來自同1例患者的ctDNA濃度TIF樣本高于CSF樣本，12 例患者的CSF 標本ctDNA 平均濃度為0.58 ng/μL，TIF 標本ctDNA 平均濃度為3.38 ng/μL，明顯高于CSF標本中ctDNA平均濃度，對比有顯著性差異（P=0.002）。CSF與TIF檢測到的基因突變頻率，測序深度均為20 000X，單CSF-ctDNA 檢測到2 種突變類型，單TIF-ctDNA檢測到32種突變類型，二者共同檢測到23 種突變類型，TIF-ctDNA 檢測到的基因類別、突變量均明顯高于CSF-ctDNA（圖5）。TIFctDNA 檢測效力更高，相對CSF-ctDNA 檢測陽性率高，能夠提供更多、更全面的腫瘤基因組信息。

3 討論

近年來隨著精準醫療和分子生物學的飛速發展，對膠質瘤在臨床中指導價值較大的某些基因被逐漸挖掘，如IDH、MGMT、EGFR、TERT等。然而由于腫瘤細胞的異質性導致腦膠質瘤原發灶和復發灶的腫瘤細胞基因表達存在不一致性，隨著腫瘤的進展及放化療的進行，腫瘤基因表達發生改變，突變基因不斷發生變化，而腦膠質瘤進行精準靶向治療，需要可以動態監測基因變化的方法。由于腦部位置特殊，手術風險大、費用高，對患者多次開顱活檢操作，患者及家屬多不能接受，在臨床上限制性較大。游離于血液、腦脊液或組織間質液中的ctDNA是各個腫瘤組織脫落的混合體，取樣方便、快捷、安全，能夠在腫瘤進展過程中多次取樣，可以克服腫瘤組織的空間異質性，ctDNA取代手術活檢標本，為腫瘤診斷和突變分析提供了一種可靠方法［9］。由于血腦屏障的存在，導致血清中ctDNA的檢出十分有限［6］，血清ctDNA并不能提供腦腫瘤患者足夠的遺傳信息。前期多項研究數據表明，CSF-ctDNA相較于血清ctDNA具有更高的組織一致性［10-11］。有研究［6］利用大規模NGS測序技術比較12例腦腫瘤患者CSF和血漿中的特異性ctDNA，發現相比血清，IDH1（R132H）、TP53（R114C）、ANK2（K2337X）在CSF中被檢出率更高，更能有效地反映腫瘤進展及其對治療的反應。

圖6 CSF-ctDNA與TIF-ctDNA檢測到的基因突變頻率

CSF-ctDNA 研究有助于膠質瘤患者早期診斷、篩選靶向藥物、早期檢測腫瘤復發。Martínez-Ricarte等［12］研究分析來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的2個腫瘤組（包括648 例彌漫性膠質瘤）的IDH1、IDH2、TP53、TERT、ATRX、H3F3A 和HIST1H3B 基因突變，對20 例膠質瘤患者的臨床腫瘤標本及CSF 中此7 個基因進行的靶向外顯子測序和微滴式數字PCR（ddP?CR）分析發現，CSF-ctDNA可對腫瘤進行準確的組織病理分型。Pentsova 等［13］使用MSK-IMPACT 技術在肺癌腦轉患者的CSF中鑒定出多種耐藥突變，如EG?FR T790M 等，為此類患者提供了靶藥指導。本研究中，PIK3CA、PTEN、KRAS、EGFR、TP53等突變基因為患者匹配到靶向潛在獲益藥物；PIK3CA、KRAS、EG?FR 突變基因匹配到潛在耐藥藥物，對臨床靶向治療具有指導作用。目前的影像學技術只能待腫瘤增長至一定體積時做出復發判斷，無法在腫瘤發生分子改變的早期做出復發診斷。ctDNA 檢測可在影像學未發現復發時在分子水平發現腫瘤基因突變，本研究中ctDNA 在分子水平發現腫瘤復發較影像學發現復發早2.9個月。

雖然CSF-ctDNA 有助于膠質瘤的早期診斷、篩選靶向藥物、早期檢測腫瘤復發，然而腫瘤DNA脫落進入CSF并非是腦膠質瘤的普遍特征。游離DNA的數量和組成受許多因素影響，包括癌癥的分期和解剖位置、腫瘤亞克隆的相對質量、生長速率、基質和炎性成分、腫瘤細胞死亡和壞死的程度。因此，CSF來源的ctDNA檢測在臨床應用上存在一定的局限性，無法檢測到更多的突變基因，檢測陽性率低，此與本研究結果相符。由于TIF 是直接來源于術后可能存在的殘存腫瘤組織或者原位復發的腫瘤組織，TIF作為膠質瘤分子基因圖譜檢測的樣本，不存在CSFctDNA 的空間分泌障礙和低級別膠質瘤的時空發展局限，能夠更直接反映當下腫瘤的真實分子生物學背景信息。Yang等［14］通過從殘留積液上清液中分離的cfDNA進行基于雜交捕獲的NGS，評估了漿液腔液中cfDNA的分子特征和臨床病理相關性，證明了從漿液腔液中分離的cfDNA 進行的液體活檢能夠為實體腫瘤基因分型提供新的來源。Panditharatna 等［15］分析了1例彌漫性中線膠質瘤患者死后的腫瘤囊腫液、CSF和腫瘤基因組DNA，發現囊液中含有大量的組蛋白突變體DNA，表明囊液中含有大量的腫瘤DNA。由于腦膠質瘤術腔間質液是直接浸透膠質瘤周圍腦組織細胞的液體微環境，瘤周組織細胞通過細胞膜和間質液發生物質交換，而且腫瘤原發灶殘存或復發壞死或凋亡的腫瘤細胞降解后的產物可直接釋放進入間質液。因此，腦膠質瘤術腔間質液ctDNA可直接精準反映原發腫瘤原發灶殘存、復發腫瘤基因變異或突變的特點，其絕對含量隨著腫瘤負荷和治療反應而發生敏感變化，其檢測結果更具有代表性。本研究結果表明TIF-ctDNA 比CSF-ctDNA 樣本中ctDNA 濃度更高，檢測到的突變類型更多，檢測陽性率更高，更能真實反映腫瘤復發過程中基因表達的變化。

綜上所述，CSF-ctDNA、TIF-ctDNA 均可作為在膠質瘤發生和復發的過程中能夠反復檢測、篩選膠質瘤標志物的一種可靠檢測方法，對膠質瘤患者基因診斷、早期檢測復發、篩選腫瘤標志物及靶向治療具有一定臨床意義。而TIF-ctDNA 較CSF-ctDNA 檢測獲得樣本ctDNA濃度更高，檢測患者基因平均突變數與檢測陽性率更高、檢測效力更高，能夠提供更多、更全面的腫瘤基因組信息，適合臨床用于獲取膠質瘤的基因表達信息。