高效液相色譜法測定食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的不確定度評定

袁 河 肖曉義, -, 劉 佳 趙志友 - 夏延斌 -

(1. 湖南省檳榔加工與食用安全工程技術研究中心，湖南 湘潭 411100；2. 湖南賓之郎食品科技有限公司檢測中心，湖南 湘潭 411100；3. 湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128)

檳榔是棕櫚科植物檳榔干燥成熟種子，含有人體所需的生物堿、多酚、氨基酸以及不飽和脂肪酸等多種營養成分和活性成分[1]。檳榔主要種植在中國的海南和臺灣，海南95%以上的檳榔以干果的形式直接銷往湖南加工成食用檳榔(亦稱檳榔嚼塊)[2]。食用檳榔在加工過程中，為了保證食用檳榔的安全性和可口性，根據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》，食用檳榔添加量適用于話化類標準，山梨酸和苯甲酸最大添加量不得超過0.5 g/kg，糖精鈉最大添加量不得超過5 g/kg。因此如何客觀準確地測量其含量對企業防腐劑的添加具有指導作用，而檳榔成分復雜且加工時會添加數十種添加劑，增加了準確測量的難度。現有研究[3-4]多是檢測檳榔中多種食品添加劑的含量，并未對其不確定進行評定。

為了能夠直觀反映各個分量對測量結果的分散性，試驗擬依據GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》開展試驗，依據不確定度評定的相關準則[5-6]，建立模型，對整個操作過程中產生不確定度進行分析得到相對標準不確定度。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及材料

乙酸銨：分析純，湖南匯虹試劑有限公司；

甲醇：色譜純，美國天地(TEDIA)試劑公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，配DAD檢測器，株式會社島津制作所；

超聲波清洗機：型號KQ-700E，昆山美美超聲儀器有限公司；

分析天平：型號EX125DZH，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

賓之郎爆珠檳榔：市售；

苯甲酸(CAS號：65-85-0)：99.0%，中國食品藥品檢定研究院；

山梨酸(CAS號：110-44-1)：99.8%，中國食品藥品檢定研究院；

糖精鈉標準品(CAS號：128-44-9)：99.9%，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗過程

采用GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中第一法(高效液相色譜法)對食用檳榔中苯甲酸、山梨酸及糖精鈉含量進行測定。

準確稱取約2 g(精確到0.001 g)試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后轉移至50 mL容量瓶中，于殘渣中加水20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r/min離心5 min，將溶液轉移到同一容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜儀測定。

2 數學模型的建立

試樣中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的含量按式(1)計算：

(1)

式中：

X——食用檳榔中待測組分含量，g/kg；

ρ——樣品溶液中待測組分的濃度，mg/L；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣質量，g。

3 不確定度來源

根據試驗方法可知，食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測定的不確定度包括：① 標準溶液的配制；② 標準曲線的擬合；③ 樣品定容；④ 樣品稱量；⑤ 回收率及儀器隨機效應。

4 結果與分析

4.1 標準物質引入的不確定度

分別稱取苯甲酸標準品59.32 mg、山梨酸標準品30.55 mg、糖精鈉標準品85.69 mg于50 mL容量瓶中，將苯甲酸、山梨酸標準品用甲醇溶解并定容，糖精鈉用超純水溶解定容。從3種標準儲備液中分別取5 mL置于同一50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，即為標準母液。

上述操作中不確定度來源于標準物質純度、稱量及容量瓶定容。

4.1.1 標準物質引入的不確定度 根據中檢院給出的標準物質純度為99.0%，99.8%，99.9%，按矩形分布，則其相對標準不確定度分別為：

4.1.2 稱量引入的不確定度 分析天平精確至0.000 01 g，區間半寬度αm=0.005 mg，假設其為矩形分布，標準不確定度為：

稱取苯甲酸標準品59.32 mg、山梨酸標準品30.55 mg、糖精鈉標準品85.69 mg，則稱量產生的相對標準不確定度為：

urel苯(m)= 2.89×10-3/59.32=4.87×10-5；

urel山(m)= 2.89×10-3/30.55=9.46×10-5；

urel糖(m)= 2.89×10-3/85.69=3.37×10-5。

4.1.3 定容引入的不確定度

(1) 容器及移液引入的不確定度：根據中華人民共和國國家計量檢定規程[7]，(25±1) ℃時，50 mL單標線容量瓶(A級)容量允差為±0.05 mL，5 mL (B級)單標線移液管允差為0.030 mL，假設其為矩形分布，則

(2) 溫度引入的不確定度：實驗室溫度在(20±5) ℃之間變化，溶液溫度與校準溫度(20 ℃)不同所引起的變化為5 ℃×2.08×10-4℃-1=1.04×10-3(2.08×10-4℃-1為水的膨脹系數)，假設其為矩形分布，則

溫度對定容體積影響所引入的不確定度為：

定容及移液引入的相對標準不確定度為：

由此得出標準物質的配制引入的相對標準不確定度為：

4.2 繪制工作曲線引入的相對標準不確定度

4.2.1 移取定容引入的不確定度

(1) 移液管引入的不確定度：分別用10 mL移液管準確吸取苯甲酸、山梨酸和糖精鈉混合標準中間溶液0.5，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻后配制成苯甲酸濃度為5.9，13.7，47.5，71.2，94.9，118.6 mg/L；山梨酸濃度為3.1，12.2，24.4，36.7，48.9，61.1 mg/L；糖精鈉濃度為8.6，34.3，68.6，102.8，137.1，171.4 mg/L的混合標準工作液。10 mL分度移液管(A級)允差為±0.02 mL，假設其為矩形分布，則

(2) 容量瓶引入的不確定度：10 mL單標線容量瓶(A級)容量允差為±0.025 mL，假設其為矩形分布，則

移取定容引入的相對標準不確定度為：

4.2.2 標準曲線擬合引入的不確定度 根據HPLC檢出濃度和峰面積之間的關系如表1所示。

表1 濃度與峰面積關系

采用最小二乘法對濃度x和峰面積y進行線性回歸計算，得到苯甲酸標準曲線為y=32.534 7x-6.605 2，r=0.999 9；山梨酸標準曲線為y=63.799 7x-16.607 3，r=0.999 8；糖精鈉標準曲線為y=22.411 4x-1.719 2，r=0.999 9。

則由標準曲線擬合引入的標準不確定度為：

(2)

式中：

s(A)——工作液峰面積殘差的標準差；

Scc——溶液含量殘差的平方和；

n——測量次數；

p——濃度梯度，mg/L；

a——標準曲線的斜率，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉斜率分別為32.534 7，63.799 7，22.411 4；

b——標準曲線截距，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉截距分別為6.605 2，16.607 3，1.719 2。

標準曲線擬合得相對標準不確定度按式(3)計算：

(3)

標準不確定度u(q)和相對標準不確定度urel(q)如表2 所示。

表2 標準曲線不確定度結果分析

由此得出標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

4.3 定容引入的相對標準不確定度

4.3.1 容器定容引入的不確定度 樣品溶液定容于25 mL

容量瓶中，容量瓶(量入式，A級)容量允差為±0.03 mL，按矩形分布，則

4.3.2 溫度引入的不確定度 溫度代入的體積影響為25 mL×5 ℃×2.08×10-4℃-1=2.6×10-2mL，假設為矩形分布，則

樣品定容引入的相對標準不確定度為：

4.4 稱量引入的相對標準不確定度

稱取粉碎后的賓之郎爆珠檳榔2 g，考慮到稱量分兩次進行，分析天平最大的允差為0.000 5 g，假設為矩形分布，則

4.5 提取過程對樣品回收率影響引入的相對標準不確定度

(4)

(5)

(6)

(7)

式中：

n——測量次數，n=9。

經計算提取過程不確定度結果如表3所示。

表3 提取過程不確定度結果分析

4.6 隨機效應引入的相對標準不確定度

用同一樣品做6個平行得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的平均含量，取矩形分布，則

(8)

urel(crep)=u(crep)/c。

(9)

經計算隨機效應不確定度結果如表4所示。

表4 隨機效應不確定度結果分析

4.7 合成標準不確定度

綜上所述，相對標準不確定度如表5所示。

表5 各個分量相對標準不確定度匯總

上述各分量相對不確定度合成標準不確定度為：

4.8 擴展不確定度

在95%置信區間下，取包含因子k=2，得相對擴展不確定度為：

Urel苯(X)=k×urel(x)=2×0.049 3=0.098 6；

Urel山(X)=k×urel(x)=2×0.059 0=0.118；

Urel糖(X)=k×urel(x)=2×0.030 8=0.061 6。

得擴展不確定度為：

U苯=0.043 8 g/kg×0.098 6=0.004 10 g/kg；

U山=0.260 g/kg×0.118=0.030 7 g/kg；

U糖=3.25 g/kg×0.061 6=0.200 g/kg。

綜上可得：食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測定結果為：

X苯=(0.043 8±0.004 10) g/kg (k=2)；

X山=(0.260±0.030 7) g/kg (k=2)；

X糖=(3.25±0.200) g/kg (k=2)。

5 結論

通過對食用檳榔檢測過程中標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品定容、樣品稱量、回收率及儀器隨機效應產生的不確定度進行分析。測定苯甲酸含量中標準曲線擬合和隨機效應代入的不確定度分別為67.5%，17.9%；測定山梨酸和糖精鈉含量中標準曲線擬合的不確定度分別為80.7%，10.1%，提取過程代入的不確定度分別為70.2%，15.8%。因此在今后的檢測工作中，針對標準曲線擬合代入不確定度的問題應該增加標準系列儲備液的測定次數、使用精密度更高的量器具和合理確定標液濃度的區間范圍；其次是隨機效應和提取過程代入的不確定度的問題應該加強操作人員的熟練度、規范試驗操作，減少人為因素對提取過程的影響，從而提高檢測結果的準確性。