簡易熒光顯微鏡的制作及其在生物醫學中的應用

翟家振，張元龍，孔令杰

(清華大學 a.精密儀器系；b.自動化系，北京 100084)

熒光顯微在生物醫學研究、新型材料表征等領域有著重要的應用[1-2]. 熒光顯微具有可特異性標記，可對活體細胞進行實時動態成像等優勢，已經成為當前生物科學研究必備的技術手段，是生物醫學光子學等課程[1]的重要內容. 但是，商用熒光顯微鏡的結構復雜、價格昂貴，這不僅為開設相關實驗課程設置了很高的經濟門檻，而且由于大部分商用熒光顯微鏡不支持用戶自行拆裝，不利于開展實驗教學. 本文結合在神經光子學課程的教學實踐，介紹了簡易熒光顯微鏡的制作方法及其在生物醫學中的應用. 通過自行設計并且組裝光學元器件，可以加深學生對熒光顯微原理的認識. 將自行搭建的熒光顯微鏡應用于觀察含熒光蛋白標記的腦組織切片，檢驗了系統的性能.

1 熒光顯微鏡的原理

傳統的光學顯微鏡是基于樣品的光吸收、相位梯度和雙折射等進行成像，成像對比度低. 熒光是當分子受到光激發時，電子從基態躍遷到激發態，經弛豫后再回到基態所輻射出的光. 由于熒光物質的激發光譜與輻射光譜之間存在著斯托克斯位移，可采用濾光片濾出發射熒光. 熒光顯微技術通過利用樣本發射熒光的特性對單個分子物質的時空分布進行成像，可顯著地提高成像對比度. 此外，可特異性熒光標記這一性能使得監測細胞內部含特定熒光團標記成分的位置及其擴散系數、轉運特性、環境因素或與其他生物分子的相互作用等成為可能[1-2].

常見的熒光標記物質主要有熒光染料、熒光蛋白和量子點等. 其中，熒光蛋白作為活體熒光材料，具有良好的生物兼容性，被廣泛應用于生物動態過程研究. 尤其是自2008年諾貝爾化學獎授予綠色熒光蛋白(GFP)的發現之后，人們發展了豐富多彩的熒光蛋白. 當前，隨著基因工程技術的進步，采用熒光蛋白標記技術不僅可以研究特定細胞或細胞器的結構及其動態變化，還可以基于鈣信號或電壓信號等研究生物動態過程. 對于不同的細胞或細胞器，采用不同光譜特性的熒光蛋白分別進行特異性標記，還可以研究它們之間的動態相互作用.

2 簡易熒光顯微鏡的制作

圖1為所設計熒光顯微鏡的系統結構圖，主要由光源、透鏡、濾光片、二色鏡、物鏡、目鏡和三維精密載物臺等組成. 上述各元件均可直接從光電器件供應商采購，參考型號如表1所示. 通過采用籠式結構，使得所設計的熒光顯微鏡的系統結構緊湊，相對于商用產品大大降低了成本. 此外，考慮到小動物成像等應用，設計中采用了背向探測的方式.

圖1 簡易熒光顯微鏡的系統結構圖

表1 簡易熒光顯微鏡的主要器件列表

與明場顯微鏡不同的是，典型的熒光顯微鏡還需要引入濾光系統. 如圖1所示，光源所發出的光透過透鏡，經濾波片1選出所需的激發波長后被二色鏡反射，再經物鏡聚焦后照在生物樣本上. 所激發出的熒光經物鏡收集透過二色鏡,再經濾波片2濾出所發射的微弱熒光后傳至目鏡. 圖像記錄可采用智能手機的攝像頭完成[3].

考慮到黃色熒光蛋白(YFP)已被廣泛應用于生物樣品的標記，本文選擇藍色LED光源(M470L3-C1，Thorlabs)作為照明光源，其中心發射波長為470 nm；相應地，激發、發射濾光片和二向色鏡選擇Thorlabs公司的MDF-YFP套裝. 為了確保照明均勻，調整透鏡的位置以實現科勒照明.

3 簡易熒光顯微鏡的應用

采用搭建的熒光顯微鏡觀察腦組織切片，檢驗系統的性能. 生物樣品為Thy1-YFP(H)成年轉基因小鼠(JAX Stock No.003782)的腦切片，其中YFP主要表達在腦皮層的第5層及海馬區的錐形神經元[4]. YFP的峰值發射波長為529 nm，與上述所選擇的濾光片套裝相匹配.

3.1 大視場、低分辨率成像

首先使用低倍率物鏡進行大視場觀察. 圖2所示為采用4×、數值孔徑0.13 的物鏡(Nikon, CFI Plan Fluor 4×)和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片熒光圖像，圖3為圖2中虛線框區域的放大顯示圖.

圖2 用4×、數值孔徑0.13 的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像

圖3 圖2中虛線框區域的放大顯示圖

可見，其視場范圍可以涵蓋小鼠的整個半腦，但是成像空間分辨率低，僅僅能分辨神經元胞體(圖3)，對于更精細的神經元結構(例如樹突、軸突)則難以分辨. 實驗中可進一步驗證，僅通過對圖像進行數字放大，無法提高成像的空間分辨率.

3.2 小視場、高分辨率成像

將物鏡切換至高倍率、高數值孔徑物鏡，可實現小視場、高分辨率成像. 圖4所示為采用10×、

圖4 采用10×，數值孔徑0.5 的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像

數值孔徑0.5 的物鏡(Nikon, CFI Super Fluor 10×)和10×目鏡組合所拍攝的熒光圖像(與圖3所示區域相同).

相對于圖2，其視場范圍減小，但是，圖4所示神經元的樹突以及由軸突構成的纖維束都清晰可見[5].

綜合上述實驗可見，實際成像中需要在光學顯微系統中成像視場與空間分辨率之間進行折中選擇. 為了獲得高分辨率的圖像，成像視場往往受到限制；反之亦然. 此外，通過引入高速圖像記錄器件，所搭建的熒光顯微鏡還可以用于研究生物動態過程，如小動物在體神經網絡活動的動態觀測.

4 結束語

針對商用熒光顯微鏡價格高昂、結構復雜等不利于實驗教學的缺點，制作了簡易熒光顯微鏡. 通過采用商用可得的光電元器件，設計搭建了簡易熒光顯微鏡系統. 將上述系統應用于觀察含熒光蛋白標記的腦組織切片，分析討論了不同物鏡放大倍率下成像視場與空間分辨率的關系. 上述系統可用于普通高校相關專業的熒光顯微鏡教學，并可應用于生物醫學研究.