除草劑Basta對番茄再生體系的影響

岳寧波　潘鵬程　潘寅濤　閆見敏　李云洲

除草劑Basta對番茄再生體系的影響

岳寧波潘鵬程潘寅濤閆見敏李云洲

（貴州大學農學院貴州貴陽550025）

以番茄()‘GZ01’材料下胚軸為外植體，探究不同濃度Basta處理對番茄愈傷組織誘導、分化以及幼苗的影響，以期為以Bar基因作為選擇標記基因的番茄轉基因遺傳轉化奠定基礎。結果表明：番茄對Basta有一定的天然本底抗性，同時，Basta對番茄愈傷組織的生長分化及葉綠素的合成具有一定的抑制作用，當Basta處理濃度小于0.5 mg·L-1時，番茄愈傷組織可以生長分化，當Basta處理濃度大于1.0 mg·L-1時，番茄愈傷組織培養后期死亡。當選擇壓濃度為1.0 mg·L-1，最宜作為番茄遺傳轉化的標記基因。

番茄；選擇壓；Basta

中國是番茄種植面積最廣的國家[1]，但我國每公頃番茄產量與其他番茄生產國相比卻較低，造成產量低的主要原因是雜草降低了作物的產量和品質，同時增加了生產成本[2]。通過化學藥劑除草是目前番茄生產中最常用的除草方式[3]，然而，殺草普廣、活性高的除草劑大多缺乏選擇性，在殺滅雜草的同時對作物也會產生藥害[4]。培育具有除草劑抗性的作物，在降低生產成本的同時也提高了作物的安全性[5]。

Basta是一種廣譜非選擇性的除草劑，其有效成分是L-phosphiothricin（PPT）的銨鹽，對植物的地上部和地下部分均有枯死作用。研究證明，轉基因的植物能表現出對除草劑Basta的抗性[6]，由于栽培的番茄在苗期通常需要人工除草，因此，表達抗除草劑的轉基因番茄可以大幅度的降低人工成本。

再生體系的優化是農桿菌介導的遺傳轉化番茄成功的關鍵[7]，而將基因作為選擇標記基因，將其應用于番茄轉基因研究中，不僅可以起到篩選轉化子的作用，而且獲得的轉基因植株還具有抗除草劑的特殊功能。目前將基因作為選擇標記基因應用于番茄基因工程中研究甚少，作為篩選抗性壓的Basta選擇壓也不知，該實驗研究了不同濃度Basta對番茄愈傷組織生長和分化的影響，并據此選擇合適的轉基因篩選壓，為以基因為選擇標記基因的番茄轉基因技術提供前提和依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試劑

番茄材料“GZ01”由貴州大學農學院植物病理實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得

精選健康的番茄種子用1.0 %的NaClO消毒5 min后，用無菌水沖洗3~5次，30 s/次，用滅菌的濾紙吸干后接種于1/2MS培養基于黑暗中培養，待種子發芽露白后置于光照強度240 mol·m-2·s-1的人工氣候培養箱內培養（光/暗：16 h/8 h，溫度：28 ℃/18 ℃（光/暗），相對濕度70 %）[1]。

1.2.2 愈傷組織的誘導及分化

選取生長10 d的無菌苗，將其子葉切割成0.5 cm2正方形小塊置于誘愈培養基（MS+3.0mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 IAA）上進行培養，葉背朝下，光照培養，每10 d進行一次繼代培養，待長出愈傷后，轉移至分化培養基（MS+2.0mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1IAA）上繼續培養。

1.2.3 Basta處理

Basta對愈傷組織的生長影響：將GZ01 番茄4-5mm大小的胚性愈傷組織接種在附加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L-1Basta的誘導培養基上，稱其重，培養4周后，觀察其生長情況，再稱其重，計算其在不同Basta濃度下增重率，每一濃度3此重復，取平均值。增重率（％）=（末重-初重）∕初重×100.0 %

Basta對番茄幼苗的影響：使用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·L-1的Basta處理5葉期番茄幼苗一周后，檢測葉綠素a和葉綠素b的含量。

2 結果與分析

2.1 Basta對愈傷組織誘導的影響

由圖1可知，Basta對番茄愈傷組織的誘導有抑制作用，當所用的Basta濃度大于1 mg·L-1時，番茄愈傷組織全部變為褐色并且死亡。而對照生長正常、膨大，外植體保持綠色，愈傷組織增重率為833.0 %。處理中Basta濃度為0.5 mg·L-1、1 mg·L-1時，外植體部分死亡，部分仍然保持綠色，隨著Basta濃度的增加，愈傷組織的增重率從883.0 %逐漸下降到99.3 %（見圖1）。

圖1　不同Basta濃度對番茄愈傷組織生長的影響

2.2 Basta對番茄幼苗的影響

由圖2可知，Basta對葉綠素a和葉綠素b的合成有一定的抑制作用，隨著Baste濃度的增加，葉片葉綠素a和葉綠素b都隨著降低，當Baste濃度大于2.5 mg·L-1，與對照達到顯著差異，抑制效果顯著。

圖2　不同濃度的Basta對葉綠素的影響

3 討論與結論

轉基因技術通常會涉及報告基因（也稱標記基因），通過報告基因指示目的基因是否成功轉入受體細胞。常用的報告基因有卡娜抗性基因（）[8]、潮霉素抗性基因（）[9]等。

該試驗通過篩選出番茄愈傷組織的最佳Basta選擇濃度，為番茄轉基因功能驗證提供研究基礎，同時也為篩選耐除草劑突變體提供研究基礎。該研究在實驗過程中還發現Basta對不定芽生根有一定抑制作用，使得以Basta為選擇壓的轉基因篩選變得困難，在該實驗中發現可以將不定芽先在添加Basta的生根培養基上篩選10 d左右，然后再轉接到不含Basta的生根培養基。這樣，陰性轉化子在前期篩選過程中死亡，陽性轉化子繼續存活，后期將存活的陽性轉化子介入不含Basta的生根培養基中生根。因此，分2個階段生根培養有助于陽性轉化子的獲得。并且通過實驗知道Basta抑制番茄幼苗的葉綠素a和葉綠素b的合成，可以通過對番茄幼苗噴施2.5 mg·L-1Basta再次篩選耐除草劑突變體。

另外，除草劑的大規模使用，節約了大量勞動力的同時，也給土壤造成一定污染，盡管一些除草劑可以降解，但是完全降解也需要一定年限，當今土地資源極度短缺，提高土地復種指數是解決土地資源短缺的主要措施，而除草劑的殘留對下一輪作物生長有一定影響。尤其在蔬菜生產中，除草劑殘留對下一茬蔬菜生長影響很大。因此，在今后的研究中應該進一步研究田間除草劑殘留對下一茬番茄生長產生的影響。

[1]Anonymous. FAOSTAT[EB/OL].www. faostat.fao.org.

[2]Bakht T,Khan I A. WEED CONTROL IN TOMATOMill.) THROUGH MULCHING AND HERBICIDES[J].Pakistan Journal Of Botany,2014,46(1):290-293.

[3]Mayerová M, Madaras M,Soukup J. Effect of chemical weed control on crop yields in different crop rotations in along-term field trial[J].Crop Protection,2018(114):215-222.

[4]賈小霞,劉石,齊恩芳,等.草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及安全性評價[J].核農學報,2019,33(10):2040-2047

[5]邱龍,馬崇烈,劉博林.耐除草劑轉基因作物研究現狀及發展前景[J].中國農業科學,2012,45(12):2357-2363.

[6]Lutz K A, Knapp J E, Maliga P,. Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance[J].Plant physiology,2001,125(4):1585-1590.

[7]賀璽強,徐恒戩,趙汝鳳.不同品種類型番茄的離體再生體系研究[J].種子,2013,32(6):11-15.

[8]Rashid A.Comparison of a kanamycin versus hygromycin resistance gene in transgenic plant selection of Arabidopsis thaliana L[J].Tissue cell,2017,1(1):1-2.

[9]Chaudhry Z,Rashid H.An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent[J].AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY,2010,9(13):1882-1891.

貴州省科技計劃項目(NO:黔科合平臺人才[2017]5788- 28)；貴州大學人才引進科研項目(NO:貴大人基合字[2017]50號)；貴州大學實驗室開放項目(NO:SYSKF2019- 55)

岳寧波(1996- )，女，貴州畢節人，碩士研究生，研究方向：蔬菜抗病育種。

閆見敏(1983- )，女，河北邯鄲人，博士，副教授，研究方向：蔬菜分子植物育種；李云洲(1986- )，男，山西晉城人，博士，講師，研究方向：蔬菜抗病育種。

S436.412

A

2095-1205(2020)05-14-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.05.07