半干旱區沙地蒿類植被建成對土壤細菌的影響

孫沛沛,錢朝菊,尹曉月,2,范興科,2,王 進,3,燕 霞,馬小飛, *,王 濤

1 中國科學院西北生態環境資源研究院 甘肅省逆境生理生態重點實驗室, 蘭州 730000 2 中國科學院大學, 北京 101408 3 中國科學院西北生態環境資源研究院 沙坡頭沙漠研究試驗站, 蘭州 730000 4 南通大學生命科學學院, 南通 226019 5 中國科學院西北生態環境資源研究院 沙漠與沙漠化重點實驗室, 蘭州 730000

半干旱區作為全球生態系統最脆弱的區域,退化土壤修復和環境問題解決是治理半干旱區生態系統所面臨的最大挑戰。研究表明,植被建成是半干旱區沙地生態恢復的有效方法之一,能夠有效的提高土壤活性和植被多樣性[1-3],并且植被生長作為沙地恢復的主要驅動力,其凋落物和根系分泌物的輸入,不僅可以為微生物提供營養,而且通過土壤細菌的有效分解,可以顯著促進土壤碳循環和氮循環[4-6],并由此形成了地上與地下相互依存的可持續系統[7]。目前關于此類系統在草地、森林和裸荒地等生態系統中的相互關系得到了較多關注和研究[2, 8],研究表明,隨著植被恢復的進行,不同地區土壤微生物隨著植物多樣性的變化而變化[3,8-9]。然而,對于單一優勢植物物種建成前后對土壤細菌多樣性和群落組成變化影響的系統研究寥寥無幾[10]。因此,本研究選取了半干旱區沙地單一優勢物種油蒿(Artemisiaordosica)和差巴嘎蒿(Artemisiahalodendron)植被,它們作為半干旱沙區優良的固沙半灌木,也是我國北方部分沙地半灌木植被群落的主要建群種,而且蒿類作為固沙先鋒植物,存在于從沙丘到蘚藻類土壤結皮發育的完整過程中,在沙地的固定、沙區生態系統的恢復與重建、生物多樣性的保護等方面具有重要作用,常作為荒漠群落恢復演替階段的關鍵指示物種[11]。此外,單一優勢種油蒿和差巴嘎蒿是分布于半干旱區的兩個姊妹種,生境差異很小[12]。因此通過研究其植被建成前后對土壤細菌的影響,對于揭示地下與地上系統的相互影響機制,深入理解植物與微生物之間的協同關系具有重要意義[13]。然而之前對沙地生態系統中油蒿和差巴嘎蒿的研究,主要集中于蒿屬植物的固沙作用、種子萌發、水分脅迫及葉片浸提液對其他植物種子的影響等[14-17],而蒿類植被建成對土壤細菌影響的相關報道較少。

本研究利用空間代替時間序列的研究方法[18],選取了半干旱區不同地理位置的兩種沙地(科爾沁沙地和毛烏素沙地)和植被建成前后的兩種土壤類型,包括：流動沙丘(無植被生長)和蘚類結皮(植被建成后期,土壤發育成熟階段),旨在系統地解決油蒿和差巴嘎蒿植被建成前后土壤細菌多樣性和群落組成的變化規律,揭示半干旱區單一優勢植被的生長對土壤細菌的影響,為進一步研究半干旱區植被建成過程與土壤微生物的相互影響機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究地點分別選取了內蒙古東部科爾沁沙地(寶古圖旅游沙漠,43°11′ N,120°38′ E)和西部毛烏素沙地(烏審旗沙漠,38°27′ N,108°42′ E)的部分區域,所選區域僅生長差巴嘎蒿或油蒿。依照油蒿和差巴嘎蒿群落建成下的土壤發育初期和后期進行取樣,兩采樣地的地理特征[19-20]比較如表1所示。

1.2 樣地選擇與采樣方法

研究所需土壤樣品采集時間為2017年6月,分別于烏審旗沙漠(38°27′ N,108°42′ E)和寶古圖旅游沙漠(43°11′ N,120°38′ E)中生長油蒿和差巴嘎蒿的區域取樣。根據空間代替時間的方法,以蒿類植被建成的兩種階段來代替建成時間的差異,分別采集了土壤發育初期和成熟期兩個階段的樣品,即蒿類植被建成前期的流動沙丘(S1)(無植被覆蓋)土壤樣品和建成后期的蘚類結皮(S2)(兩沙地中半灌木油蒿和差巴嘎蒿均生長旺盛,株高約80 cm,株距約100 cm；葉羽狀細裂,小裂片呈線狀或絲狀,為綠色；地表由枯落葉等物形成一層黑色的結皮)土壤樣品[21-22],這樣設計實驗,一方面能夠研究蒿類植被群落建成對不同發育程度土壤的影響,另一方面也能調查蒿類植被恢復對不同沙地土壤的影響有無共性。

在取樣時,在每個研究區地勢相對較為平坦的地方先設置3個20 m×20 m的純蒿類生長的樣地,在每個樣地中針對所需兩種土壤類型,分別再選擇20 cm×20 cm的樣方,從樣方中利用土鉆采集土壤樣品(每個樣品3個重復)。對于兩沙地中流動沙丘取樣時,分別采集沙地迎風坡深度為0—10 cm的土壤樣品,其中0—2 cm記為上層土樣,2—10 cm記為下層土樣；對于兩沙地發育成熟階段土壤,由于均有結皮的存在,我們分三層取樣,總深度依然為0—10 cm,其中0—1 cm記為結皮層土樣,1—3 cm記為中層土樣,3—10 cm記為下層土樣。最后兩沙地共獲得30個土壤樣品,將所取得土壤樣品裝入自封袋中,并立即放入干冰保存,最后以快遞的形式立即送回實驗室,一部分風干保存,用于測定土壤理化性質,另一部分置于-80℃的冰箱中保存,用于后續細菌測序分析。

表1 科爾沁沙地與毛烏素沙地地理特征比較

1.3 實驗方法

1.3.1土壤理化性質測定

在測定土壤理化性質的過程中,將采集的樣品自然分干后,磨碎后過20目的篩后保存,用于含水率(Moisture content,%)、pH值(土∶水=1∶2.5)、總碳(TC, g/kg)、總氮(TN, g/kg)、全磷(TP, g/kg)和電導率(Conductivity,土∶水=1∶5, us/m)的測定。采用1∶5(w∶v重量∶體積)的水溶液測定電導率；用 pH計測1∶2.5的水溶液記為pH值；總氮采用凱氏定氮儀(KDY-9830)進行測定；采用C/N分析儀(LECO Truspec, MI, USA)測定土壤總碳。

1.3.2土壤微生物多樣性測定

采用OMEGA Soil DNA kit (200)[23]的方法從0.5g土壤樣品中提取DNA,用1% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop微量核酸蛋白濃度測定儀檢測土壤樣品DNA純度和濃度,質檢結果符合分析要求,隨后送往上海歐易生物醫學科技有限公司進行細菌16s rRNA測序分析。由 Illumina Miseq[24]平臺測序所得數據,其中測序區域為V3 - V4；引物序列分別為：前端引物: 343F - 5′- TACGGRAGGCAGCAG -3′；后端引物: 798R - 5′- AGGGTATCTAATCCT-3′。在微生物多樣性測序分析中,原始雙端測序數據首先需要進行去雜(去雜步驟可以進一步提高拼接率,去掉3′ 端或5′ 端一些模糊堿基或者低質量堿基)并拼接,隨后對拼接后的paired end數據進行進一步去雜,進一步去除低質量的堿基序列以及模糊堿基序列,將獲取的序列定義為clean tags,之后需要對clean tags進行去嵌合體序列處理,最終得到較優質的序列即valid tags,并進行后續分析。

1.3.3統計和生物信息學分析

對獲得的valid tags數據首先進行分類Operational Taxonomic Unit[25](OTU),即對所有的優質序列使用VSEARCH (v2.4.2)[26]軟件以97% 相似度進行OTU劃分。隨后從OTU中挑選豐度最大的序列作為代表序列。與Silva數據庫 (v123)[27]進行比對后最終得到系統發育樹和OTU分類表格。最終執行之后的alpha和beta多樣性分析。在alpha多樣性分析時,可通過6種指標(Observed Species稀釋曲線、Chao[28]指數、Shannon Wiener指數、Simpson[29]指數、Good′s Coverage[30]指數、進化距離指數[31])來分析生境內的樣本多樣性。使用蒙特卡羅排列(999次重復)的Pearson相關分析和冗余分析(RDA)來測試土壤性質與細菌群落之間的關系；該研究中的土壤理化性質和細菌群落數據統計分析運用軟件IBM SPSS Statistics 22[32](SPSS Inc, Chicago, USA)進行,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和 LSD 比較土壤發育不同階段和不同深度土壤性質和微生物多樣性的差異性,顯著性水平設定為α=0.05,用Origin Pro 7.5作圖。運用 R軟件3.5.2版本[33]中的vegan包(https://www.r-project.org/)進行相關性和RDA分析。

2 結果分析

2.1 土壤理化性質

隨油蒿和差巴嘎蒿群落建成前后沙地土壤部分理化性質的測定結果如表2所示,結果表明,土壤中總氮、總碳和全磷在土壤發育成熟階段S2的含量顯著大于發育早期階段S1的含量；電導率也隨著土壤發育而逐漸增大；含水率在植被建成后期稍高于前期；而pH值在不同階段中沒有明顯差異。在不同深度上,S1時期,兩種沙地土壤中總氮表現為隨著深度的增加,含量逐漸增加； S2時期,隨著深度的增加,含量表現為：中層 > 下層 > 結皮層；總碳、全磷和電導率在不同深度上的含量表現與前者稍有差異,具體表現為S1時期,它們的含量均隨著深度的增加而降低,S2時期,含量變化與總氮在S2期的變化相同；pH值在整個演替過程中,與總氮在S2期的變化相同；pH值在整個演替過程中,隨著深度的變化不顯著；含水率在植被建成前后表現出相同的規律,均隨著深度的增加,含水率上升。

表2 植被建成前后土壤的理化性質

2.2 土壤細菌群落隨植被建成前后的變化

土壤細菌16s rRNA測序數據經質控和去嵌合體后,得到 valid tags(最終用于分析)數據量分布在 12535—48385 之間,各樣本 OTU 個數分布在 975—3468 之間。對不同樣本的Shannon-Wiener指數利用ANOVA單因素方差分析,結果表明,油蒿和差巴嘎蒿群落植被建成對土壤細菌alpha多樣性的總體影響不顯著(圖1),但蒿類建成對土壤細菌群落結構的影響顯著,細菌群落相對豐度在門類水平上的變化如圖2所示。所有土壤樣品中優勢種群分別是：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌(Actinobacteria)。另外,兩沙地中不同階段優勢菌的相對豐度變化具有差異性,如擬桿菌在成熟期土壤中的相對豐度高于植被建成前流動沙丘中的相對豐度(圖2)。從不同階段來看,在S1期,厚壁菌門、擬桿菌和變形菌門的相對豐度隨著采樣深度增加,在兩種沙地土壤中均呈下降趨勢,而放線菌相對豐度隨著采樣深度的增加,在兩沙地土壤中變化不顯著(圖3)。在S2期,在不同沙地中,土壤中厚壁菌門相對豐度隨著采樣深度的增加而增加；擬桿菌的相對豐度在寶古圖(BGT)沙漠土壤中表現為隨著深度的增加,先降低后增加,而在烏審旗(WSQ)沙漠土壤中,其相對豐度則隨著深度的增加而增加。變形菌門的相對豐度隨著采樣深度的增加,在兩沙地中具有相同的變化規律,均隨著深度的增加而降低；放線菌的相對豐度在寶古圖沙漠土壤中,中間層的相對豐度最高,而在烏審旗沙漠土壤中,隨著深度的增加,相對豐度依次減少(圖4)。由以上結果證明,油蒿和差巴嘎蒿群落作為荒漠恢復的先鋒種,其恢復建成對土壤細菌的群落組成具有顯著影響。

圖1 土壤細菌Shannon指數在不同階段的變化Fig.1 Changes of Shannon index of soil bacteria in different stages樣品編號一欄中,“BGT”代表寶古圖旅游沙漠區域樣品,“WSQ”代表烏審旗沙漠區域樣品；字母后面數字代表樣本兩個不同階段,“1”代表流動沙丘類型,“2”代表蘚類結皮類型；(2) “s, m, b”代表不同的采樣深度,依次為“上層,中層,下層”；(3)表中“u1,u2”分別表示同一地區的不同階段的樣品

2.3 土壤理化性質與細菌群落之間的關系

通過冗余分析,考察環境變量(優勢菌門類群)和土壤理化性質(總碳(TC)、總氮(TN)、全磷(TP)、電導率(EC)含水率(MC)和pH)之間的關系(圖5)。可以看出,大部分優勢菌群與土壤理化性質間存在顯著相關性。具體來說,擬桿菌(Bacteroidetes)與土壤理化性質存在顯著正相關性,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和放線菌(Actinobacteria)的組成變化主要受電導率的影響,并在兩沙地土壤結皮樣品中鹽類含量最高。另外,全磷、總碳、pH、和總氮是影響細菌豐度變化的主要土壤因子。這些結果表明,土壤性質與細菌群落組成存在較強的相關性,并且土壤理化性質驅動著細菌群落的組成。

圖2 門類(phylum)水平下土壤細菌群落結構組成Fig.2 Community composition of soil bacteria in phylum

圖3 兩沙地S1階段土壤中優勢細菌Fig.3 Soil dominant bacteria of S1 stage in two sandy lands

圖4 兩沙地S2階段土壤中優勢細菌Fig.4 Soil dominant bacteria of S2 stage in two sandy lands

3 討論

3.1 土壤性質與細菌隨蒿類植被建成前后的變化

通過研究發現,油蒿和差巴嘎蒿群落恢復顯著提高了土壤養分(表2),尤其是提高了總碳、總氮的含量和電導率值,并且在不同的沙地中變化規律基本一致。另外,pH值在植被階段中,變化不顯著,這也與之前研究不同年代土壤恢復下的pH值變化結果相同[34-35],由此表明單一優勢種蒿類植被群落建成不改變土壤酸堿度。而從采樣深度來看,不同階段下垂直分布上具有差異性,出現這一結果可能的原因為：在蒿類植被建成前后,土壤表層植被覆蓋率差異顯著,在流動沙丘土壤中,由于土壤表面無植被覆蓋,所以表層土壤很容易被風帶走,不利于土壤養分的累積,隨著深度的增加,土壤養分在不同沙地中均有提高。而發育成熟的蘚類結皮土壤中,在越靠近地表的土壤中,由于細菌對油蒿和差巴嘎蒿植被凋落物的分解作用,使得土壤養分顯著提高,并且植被能夠有效的抵御風沙的侵蝕,故利于土壤養分的沉積,進一步說明油蒿群落不僅能防風治沙,也能促進土壤發育[12]。

從16s rRNA測序數據來看,隨著蒿類植被建成,不同階段下細菌多樣性沒有顯著差異(圖1),這與之前的研究不一致[3, 36],前期對廢棄土壤演替發育過程的研究表明,其細菌群落alpha多樣性指數隨著時間序列逐漸增大。相反,關于保護區草地、森林和稻田土壤次生演替的細菌alpha多樣性沒有發生變化[1, 37-38]。這些研究結果與我們的研究結果相同(表2),可能與植被覆蓋率和多樣性有關,即在無干擾因素下的單一植被物種建成對土壤細菌alpha多樣性影響。然而,盡管細菌多樣性指數在不同階段沒有顯著變化,但是細菌群落組成在不同階段具有較大差異(圖2),優勢菌的相對豐度隨著油蒿和差巴嘎蒿群落建成發生了變化,并且不同階段的優勢菌的相對豐度在垂直分布上也發生了變化(圖3和圖4)。本研究中細菌群落結構發生的變化結果與Lozano等[2]人研究干旱區次生演替過程中土壤微生物和植被群落間相互關系的研究結果相似。細菌群落結構在演替初期和后期的變化,可能與不同細菌的主要功能有關,例如后期藻類細菌能夠進行光合作用,并能夠降低土壤水分蒸發速率[39],故在演替后期的相對豐度高于早期,從而也能保持后期土壤中含水率。另外,本項研究揭示了不同地理位置的沙地在同種土壤類型下細菌群落結構組成變化具有相同的變化規律,由此證明油蒿和差巴嘎蒿群落對沙地土壤細菌群落結構的影響具有相似性。

細菌群落結構結果表明,擬桿菌、變形菌門、放線菌是優勢菌門,這在其他不同環境條件下也有類似的結果[36, 40]。然而,本研究中厚壁菌門是土壤發育初期和后期中相對豐度最高的菌門,該結果與其他環境土壤中優勢菌有差異,這主要與厚壁菌門的特性相關,在半干旱區土壤養分匱乏的條件下,厚壁菌門吸收營養的能力遠大于擬桿菌等其他菌門,故其相對豐度較高。我們的研究結果顯示在土壤不同發育階段和不同深度下優勢菌的相對豐度具有不同的變化,例如厚壁菌門在流動沙丘土壤中隨著深度的增加,相對豐度降低,在蘚類結皮土壤中,隨著深度的增加,相對豐度逐漸升高。出現這種結果,很大程度上可能與土壤養分有關,地上部分為地下細菌群落提供了豐富的養分,而地下細菌群落通過對地上部分凋落物的分解,增加了土壤總碳、總氮等土壤養分,土壤養分又會影響地下細菌群落的組成,從而組成地上與地下相互影響的完整系統,也進一步證實土壤養分和植被組成是土壤群落形成的兩個主要驅動力[41-42]。

圖5 細菌優勢菌群與土壤理化因子關系的RDA二維排序圖Fig.5 RDA two-dimensional diagram of the relationship between dominant bacteria and soil physicochemical factorsTC: 總碳Total carbon；TN: 總氮Total nitrogen；TP: 總磷Total phosphorus；EC: 電導率Electrical conductivity；MC: 含水率Moisture content

3.2 土壤性質和細菌群落間隨蒿類植被建成的相互關系

本研究發現,油蒿和差巴嘎蒿群落植被建成顯著增加了土壤養分,改變了細菌群落組成,這也與很多其他土壤發育類型的研究結果相同[43-44]。一般來說,土壤細菌群落隨著土壤性質和植被群落的變化而變化,因為植被凋落物能夠影響土壤理化性質,進而影響微生物群落結構,植物通過影響土壤養分的變化來改變細菌群落組成[2]。相似的,從研究結果來看,土壤理化性質對細菌群落多樣性沒有顯著影響,而是影響了細菌的群落組成,其他研究中也有相似結果[45]。細菌群落的發育與其生活的土壤條件密切相關,在本研究中,部分菌的相對豐度在蒿類植被建成后期明顯高于前期(圖2),例如變形菌和放線菌在后期的相對豐度高于前期,這很可能是由于土壤中總碳、總氮、總磷和鹽分的含量變化引起的。由冗余分析(RDA)也能夠看出變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門與土壤養分呈正相關,而部分優勢菌(如厚壁菌門)與土壤養分呈負相關(圖5),這一結果也正好與土壤理化性質和優勢菌的相對豐度隨植被建成不同階段的變化結果相吻合。細菌豐度隨土壤養分的變化,主要是與其自身生長條件有關,例如變形桿菌是一種共生養菌,正如之前的研究報道的那樣,當有不穩定的底物時,其生長迅速[46]。并且在不同沙地中,細菌群落結構隨著土壤性質變化具有共性。

4 結論

通過對半干旱區沙地油蒿和差巴嘎蒿植被建成對土壤細菌影響的研究表明,寶古圖沙漠土壤和烏審旗沙漠土壤隨著油蒿和差巴嘎蒿群落植被建成中,土壤細菌多樣性沒有明顯變化,而對土壤理化性質和細菌群落結構具有顯著變化。具體表現為：在蒿類植被建成不同時期,土壤養分含量在蘚類結皮中明顯高于流動沙丘樣品中,而pH值變化不明顯；土壤中總碳、總氮、全磷和電導率等因子在不同時期,隨著深度的不同,也具有不同的變化規律。土壤細菌群落結構中優勢菌分別為厚壁菌門、擬桿菌、變形菌門和放線菌,他們的相對豐度隨著蒿類植被建成而發生了變化,并且同一深度不同植被建成時期下,優勢菌相對豐度的變化有差異；可以得出油蒿和差巴嘎蒿群落建成顯著提高了土壤養分,進一步影響了細菌群落結構的變化,因此地上與地下部分組成了一個相互依賴的系統。另外,從油蒿和差巴嘎蒿群落建成的兩個階段期和土壤采樣不同深度來看,兩種沙地同時期下土壤理化性質和細菌群落組成變化規律相似,由此說明油蒿和差巴嘎蒿群落建成對不同沙地土壤細菌的影響具有共性。