基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討斑蝥素抗小細胞肺癌的分子機制研究

沙宗閣，楊欣，楊長福，黃高，鄭子安，劉楊，任勇

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為腫瘤相關(guān)病死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌最主要的病理類型為腺癌、鱗癌和小細胞癌,根據(jù)組織學特性臨床中將肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC)以及小細胞肺癌(SCLC)兩大類型。其中NSCLC可分為腺癌、鱗狀細胞癌以及大細胞癌[2]。SCLC由于其神經(jīng)內(nèi)分泌特性可以被清楚地鑒別出來，除形態(tài)學以及組織學以外，根據(jù)生長速度以及遠處轉(zhuǎn)移的難易程度特性又將小細胞肺癌分為局限性疾病以及廣泛性疾病。

斑蝥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味辛，性熱，有大毒。歸肝、胃、腎經(jīng)。功可破血散結(jié)、攻毒蝕瘡[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究報道，斑蝥具有抗癌活性，對惡性腫瘤尤其是晚期癌癥有較好的治療效果，如治療胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等[5-6]，但是其毒性限制了在臨床的廣泛應(yīng)用。斑蝥中有效抗癌成分是斑蝥素，其在抑制腫瘤細胞的同時對機體沒有明顯的免疫抑制作用，這是抗癌藥物中突出的特點[7]，對肺癌、乳腺癌等有一定效果[8]。斑螯素可以抑制癌細胞中的DNA、RNA合成，通過干擾DNA的復(fù)制及mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，進而影響細胞的分裂與蛋白質(zhì)的合成，最終抑制癌細胞的生長、分裂[9-10]。為了進一步探討斑蝥素在小細胞肺癌中的作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理方法，篩選化學成分-疾病靶點，對其靶點進行生物信息學分析，采用分子對接驗證分析，進一步明確斑蝥素抗小細胞肺癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

GeneMANIA (http://genemania.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards(https://www.genecards.org/)。STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl)；RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb )。

1.2 斑蝥素靶標蛋白篩選

斑蝥素基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點篩選，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認，篩選結(jié)果包括蛋白名稱、Uniprot ID等信息。

1.3 小細胞肺癌靶點篩選

基于GeneCards(https://www.genecards.org/) 和CTD(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫篩選小細胞肺癌靶點，以“Small Cell Lung Carcinoma”為關(guān)鍵詞進行篩選，選擇Relevance score≥25為小細胞肺癌的關(guān)鍵靶點。

1.4 相互作用分析

基于快速預(yù)測蛋白功能軟件GeneMANIA (http://genemania.org/)對24個靶點進行富集分析，該數(shù)據(jù)庫可基于共定位(co-localization)、共表達(co-expression)、物理相關(guān)性占(Physical Interactions)、預(yù)測(Predicted)、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)等對基因集進行分析和預(yù)測。輸入24個靶蛋白的Gene id的，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認。

1.5 關(guān)鍵靶點篩選

STRING(https://string-db.org/)結(jié)合Cytoscape通過degree 篩選關(guān)鍵靶點，選擇輸入方式是“Multiple proteins”，輸入小細胞肺癌靶點24個，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認[11]。點擊“Exports”選項，下載TSV格式的文件保存，導入Cytoscape軟件，選擇cytoHubba模塊，根據(jù)degree輸出前三個關(guān)鍵靶點[12]。

1.6 分子對接驗證分析

斑蝥素與3個靶標蛋白分子對接基于iGEMDOCK軟件，靶標蛋白EGFR (PDBID:1M17)，PTGS2(PDBID:3W15)和(PDBID:4G8A)從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb)獲取3D晶體結(jié)構(gòu)[13]，分子對接相關(guān)參數(shù)參數(shù):解的個數(shù)(number of solution)2，子代 (Generation)70。群體大小(generic evolutionary method)200[13]。

2 結(jié)果

2.1 靶點篩選

基于CTD和Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選小細胞肺癌，選擇Relevance score≥25為關(guān)鍵靶點，基于CTD獲得1 788個小細胞肺癌靶點，基于Genecards獲得1 077個小細胞肺癌靶點，通過FunRich軟件取交集，共獲得小細胞肺癌靶點673個(圖1 A)。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出斑蝥素化學成分靶點100個(圖1B)，采用FunRich 取交集篩選出24個靶點(圖1B)。斑蝥素-小細胞肺癌共有靶點見表1。

注:A:小細胞肺癌靶點;B:化學成分-小細胞肺癌共有靶點。圖1 化學成分-疾病靶點

表1 斑蝥素-小細胞肺癌共有靶點

2.2 靶點相互作用分析

24個靶點基于GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用，其中共定位(co-localization)占0.98%、共表達(co-expression)占35.49%、物理相關(guān)性(Physical Interactions)占34.86%、預(yù)測(Predicted)占20.20%、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)占4.65%、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)占1.86%，見圖2。

圖2 GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用

2.3 關(guān)鍵靶點分析

基于STRING結(jié)合Cytoscape通過degree篩選，選擇degree大于12的為關(guān)鍵靶點，EGFR、PTGS2和TLR4為關(guān)鍵靶點，見圖3。

圖3 關(guān)鍵靶點篩選

2.4 iGEMDOCK分子對接結(jié)果

通過分子對接發(fā)現(xiàn)，結(jié)果以斑蝥素和EGFR、PTGS2、TLR4大分子匹配能量的大小決定結(jié)合的程度。如果匹配能量比較低，說明小分子和大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定。斑蝥素與3個靶點有結(jié)合。其中作用最好的為PTGS2，見表2。

表2 斑蝥素與靶標蛋白分子對接

3 討論

近年來隨著多學科的交叉，系統(tǒng)生物學、計算生物學、蛋白質(zhì)組學等技術(shù)的融合，對中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供創(chuàng)新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)，可以闡述機體與藥物相互作用的原理與規(guī)律，為中藥治療疾病的作用機制提供理論指導，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學已被廣泛應(yīng)用于中藥研究[14]。已經(jīng)有研究表明[15],斑蝥素具有抗肺癌的作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選斑蝥素調(diào)節(jié)的靶標蛋白，通過與小細胞肺癌靶點進行整合，對靶標蛋白進行富集分析、關(guān)鍵靶點篩選，通過分子對接對關(guān)鍵靶點進行驗證分析，進一步探討其發(fā)揮防治小細胞肺癌的分子機制，從而為斑蝥素的應(yīng)用及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

斑蝥素為中藥斑蝥中活性成分之一，為倍半萜類衍生物。斑蝥素藥理作用廣泛，具有較好的應(yīng)用前景，臨床已經(jīng)應(yīng)用斑蝥素注射液治療癌癥，而且具有較好的治療效果。本研究通過相互作用發(fā)現(xiàn),EGFR、PTGS2和TLR4為小細胞肺癌的核心靶點，通過分子對接驗證分析發(fā)現(xiàn)斑蝥素與PTGS2有結(jié)合，可能具有很好的相互作用。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)包括組成型PTGS1和誘導型PTGS2，PTGS2又稱環(huán)氧合酶2(COX-2)[16]。在前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。結(jié)肺癌、直腸癌、食管癌、家族性腺瘤性息肉病組織中的PGE2水平升高，目前COX-2已成為抗癌藥物開發(fā)的新靶點[17-18]。Toll樣受體4(TLR4)在炎癥反應(yīng)信號發(fā)揮作用，為最早的Toll樣受體亞型之一，在單核細胞、樹突狀細胞、小腸上皮細胞、中性粒細胞等均有表達，多種疾病與TLR4具有相關(guān)性[19]；表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變或異常表達影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，EGFR在細胞增殖、信號傳導及各種調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用，但是多種腫瘤中過度表達并失去控制，因此研究EGFR靶向藥已經(jīng)成為熱點[20]。已經(jīng)有研究表明斑蝥素在抗病毒、抗腫瘤和增強免疫等功能，主要用于治療原發(fā)性肝癌，并對肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等有一定的療效[21]。本研究的篩選為斑蝥素在小細胞肺癌中的應(yīng)用提供依據(jù)。