漢黃芩苷對糖尿病大鼠腎組織炎癥因子表達及TLR4／NF?κB 信號通路的影響

趙 新

（周口職業技術學院， 河南周口466000）

據國際糖尿病聯盟的統計數據顯示，全球糖尿病患者總數為4.25 億，而中國糖尿病發病人數位列全球第一，高達1.14 億，且發病率呈現逐年遞增趨勢［1］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 為糖尿病最為常見的并發癥，30%～40%糖尿病患者會出現DN，危害嚴重［2］。當前，微循環障礙、糖代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應及胞內信號轉導異常是DN 發病的主要機制［3］。腎組織炎癥因子大量表達及TLR4／NF?κB 信號通路異常，可導致腎小球系膜細胞增殖而使間質纖維化，進而促進DN 的發生、發展［4?5］。漢黃芩苷為傳統中藥黃芩中的黃酮類單體物質，具有降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護神經、心血管系統等多種藥理活性［6］。研究發現［7］，漢黃芩苷具有增加糖原合成改善肝胰島素抵抗及促進HepG2 細胞葡萄糖攝取等作用，其機制與降低炎癥因子表達及激活胰島素降糖通路有關，但目前關于漢黃芩苷治療DN 的研究報道較少。本研究通過給予鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 誘導的糖尿病模型大鼠不同劑量的漢黃芩苷，旨在探討其是否具有腎組織保護作用，并以腎組織炎癥因子表達及TLR4／NF?κB 信號通路為切入點，研究其作用的分子機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠，SPF 級，體質量（200±20） g，由河南省實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK （豫）2017?0001。

1.2 藥物與試劑 漢黃芩苷 （純度＞90%，批號2019021601） 購自成都彼樣生物科技有限公司，漢黃芩苷用0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose?Na，CMC?Na） 配成10 mg／mL 混懸液，作為貯備液。STZ 購自大連美侖生物技術有限公司；血糖、胰島素（insulin，INS）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿微量白蛋白（urine microalbumin albumin，UmAlb） 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；血肌酐（serum creatinine，Scr） 檢測試劑盒購自廈門寶太生物科技有限公司；TNF?α、IL?1β、IL?18檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗TLR4、NF?κB p?p65、NF?κB p65 多克隆抗體購自美國Protein Tech公司；抗β?actin 抗體購自中國博奧森生物有限公司。

1.3 儀器 GG?2000 型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）；HGM?114 型血糖儀［歐姆龍醫療器械（北京） 有限公司］；GF?D800 型半自動生化分析儀（山東高密彩虹分析儀器有限公司）；ELX 型全自動酶標儀（美國Bio Tek 公司）；LF型蛋白電泳及轉移儀（北京龍方科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 SD 大鼠適應性喂養3 d，腹腔注射STZ （60 mg／kg） 復制糖尿病大鼠模型。72 h后，測空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG） 水平，當FBG ≥16.7 mmol／L時，判斷為糖尿病模型成功建立。按體質量將成模大鼠隨機分模型組及漢黃芩苷高、中、低劑量組，另設正常組，每組10 只。漢黃芩苷高、中、低劑量組每天以40、20、10 mg／kg 灌胃給藥，1 次／d，正常組及模型組大鼠灌胃等體積的0.5% CMC?Na，連續8 周。

2.2 標本收集及指標測定 實驗結束后，收集各組大鼠24 h 尿量，采用免疫比濁法檢測UmAlb 水平；乙醚麻醉大鼠后行股總動脈采血，葡萄糖氧化酶法檢測FBG 水平，放射免疫法檢測INS 水平。血清Scr、BUN 水平及TNF?α、IL?1β、IL?18 水平采用ELISA 法測定，操作步驟按試劑盒說明書指南進行。

2.3 HE 染色 將已經固定好的腎臟組織制成3 μm 厚的石蠟切片，先后經脫蠟、浸水、蘇木精染色、伊紅染色、脫水及二甲苯透明等步驟后，在光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態改變情況。

2.4 Western blot 檢測 取100 mg 腎臟組織，用組織蛋白裂解液500 μL 進行勻漿處理；離心后分離上清液，BCA 法測腎組織蛋白濃度。加上樣緩沖液，煮沸變性，蛋白分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法。經轉膜、封閉及TBST 洗膜后，加入相應的TLR4、NF?κB p?p65 及NF?κB p65 多克隆抗體，均為1 ∶2 000 稀釋，在4 ℃條件下孵育過夜。常溫下，繼續加入二抗孵育1 h；化學發光法顯色，曝光并經圖像分析軟件處理，與內參蛋白β?actin 比較，計算目的蛋白相對表達量。

2.5 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，計量資料以（） 表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠一般狀態、體質量及腎臟指數的影響 在為期8 周的給藥過程中，正常組大鼠精神狀態較佳，攝入食、水量及大小便均正常，自如移動，反應迅速，皮毛順滑；與正常組比較，模型組大鼠精神狀態較差，出現典型的多飲、多食、多尿的癥狀，活動量明顯減少，反應遲緩，毛色暗淡，皮毛失去光澤；經漢黃芩苷（40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠多飲、多食、多尿癥狀有一定程度的改善，精神狀態也有好轉。如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠體質量降低，而腎臟指數升高（P＜0.01）；與模型組比較，漢黃芩苷組大鼠體質量升高（P＜0.01），而腎臟指數降低（P＜0.01）。

表1 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠體質量及腎臟指數的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠FBG、INS 水平均升高（P＜0.01）；經漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、INS 水平均降低（P＜0.01），見表2。提示漢黃芩苷可以降低糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平，具有抗糖尿病作用，且該作用呈明顯的劑量依賴關系。

表2 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響（， n＝10）

表2 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠FBG、INS 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎功能相關指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠UmAlb 水平及血清Scr、BUN 水平均升高（P＜0.01）；經漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠UmAlb水平及血清Scr、BUN 水平均降低（P＜0.01），見表3。

表3 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎功能相關指標的影響（， n＝10）

表3 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎功能相關指標的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織病理形態的影響 如圖1 所示，正常組大鼠腎臟無纖維組織增生及基底膜增厚，系膜細胞和基質無增殖，腎小球和腎小管及間質結構正常，腎組織結構清晰完整、形狀規則；模型組大鼠可見胞外基質增生，系膜細胞增殖，系膜擴張，腎小球肥大和腎小球基底膜增厚，部分腎小管萎縮等現象。漢黃芩苷各給藥組與模型組比較，病理形態均有一定程度的改善，其中漢黃芩苷（40 mg／kg） 效果最好，改善最為明顯。

3.5 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均升高（P＜0.01）；經漢黃芩苷（40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表4。此結果可初步說明，漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中細胞炎癥因子的表達，通過減輕炎癥反應緩解糖尿病模型大鼠的腎臟損傷。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態（HE，×40）

3.6 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號通路的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達均升高（P＜0.01），而NF?κB p65 蛋白表達無變化 （P＞0.05）；經漢黃芩苷 （40、20、10 mg／kg） 治療8 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達均降低（P＜0.01），而NF?κB p65 蛋白表達無變化（P＞0.05），見圖2、表5。此結果可進一步說明，漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達，通過調節TLR4／NF?κB 信號通路發揮腎臟保護作用。

表4 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平的影響（， n＝10）

表4 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠血清TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平的影響（， n＝10）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖2 Western blot 法檢測TLR4／NF?κB 信號通路相關蛋白表達

表5 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號通路的影響（， n＝10）

表5 漢黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織TLR4／NF?κB 信號通路的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

4 討論

DN 是由腎臟供血的毛細血管受到損傷而導致的一種炎癥性疾病，降低血清中的炎癥因子TNF?α、IL?1β 及IL?18等的水平有利于DN 的治療［8］。TNF?α、IL?1β 及IL?18 等炎癥因子的表達與腎小球濾過率變化、內皮通透性改變、血流動力學降低、單核巨噬細胞聚集等密切相關［9］。既往研究［10］表明，漢黃芩苷能在轉錄水平通過抑制佛波酯誘導的人單核THP?1 細胞中Nod 樣受體蛋白3 及IL?1β 的表達發揮抗炎作用。此外，漢黃芩苷也可以通過降低TNF?α、IL?6等的表達，抑制脂多糖誘導的巨噬細胞RAW264.7 炎癥反應［11］。本研究結果發現，與模型組比較，漢黃芩苷各組大鼠TNF?α、IL?1β 及IL?18 水平均明顯降低，提示漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠血清中細胞炎癥因子的表達，通過減輕炎癥反應緩解糖尿病模型大鼠的腎臟損傷。

TLR4／NF?κB 信號通路在各種炎癥因子相互作用和相互影響的復雜網絡中起著中心調控作用。Toll 樣受體可激活多種細胞因子，其位于NF?κB 信號通路的上游，進而誘發一系列炎癥反應［12］。在DN 發展過程中，作為激活炎癥信號通路中的重要調節分子TLR4 和NF?κB，其過度活化或表達水平上調，是誘發糖尿病腎損傷的重要分子機制［13］。漢黃芩苷可以抑制脂多糖誘導的急性肺損傷，其機制與抑制TLR4 介導的NF?κB 炎癥信號通路中IκB 和NF?κB p65 蛋白的磷酸化表達有關［14］。本研究結果發現，與模型組比較，漢黃芩苷各組大鼠TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達均明顯降低，提示漢黃芩苷可抑制糖尿病模型大鼠腎組織TLR4、NF?κB p?p65 蛋白表達，通過調節TLR4／NF?κB 信號通路發揮腎臟保護作用。

綜上，漢黃芩苷具有抑制炎癥因子表達及調控TLR4／NF?κB 信號通路的作用，該作用是發揮保護糖尿病模型大鼠腎組織損傷功能的重要機制。