miRNA對畜禽脂肪沉積的影響及在遺傳育種中的應(yīng)用

李心語 安清明 王大會

摘要：畜禽基因與其性狀的關(guān)聯(lián)研究較為廣泛，具有編碼效應(yīng)的DNA和RNA對性狀有重要影響，非編碼RNA中的miRNA可以通過影響mRNA的翻譯而對畜禽的性狀產(chǎn)生特定影響。總結(jié)了miRNA在畜禽脂肪代謝中的研究進(jìn)展，以期為今后進(jìn)一步研究畜禽脂肪組織中miRNA的表達(dá)和功能提供參考。

關(guān)鍵詞：miRNA;脂肪沉積;畜禽;育種

Abstract： The association between genes and characters of livestock and poultry was widely studied. DNA and RNA with coding effect have important effects on traits. In addition， miRNA in non-coding RNA can have a specific effect on livestock and poultry traits by affecting the translation of mRNA. The research of miRNA in fat metabolism of livestock and poultry was summarized， in order to provide reference for further research on the description and functions of miRNA in fat tissue of livestock and poultry.

Key words： miRNA; fat deposition; livestock and poultry; breeding

在動物的生長過程中，除了肌肉的增長，還有脂肪的沉積，脂肪沉積是動物體脂肪合成與分解兩個過程協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜生化過程，受多種因素影響。在動物成年后，皮下、肌肉和內(nèi)臟都易沉積更多脂肪，而大量脂肪的沉積可能會對動物的某些性狀及生理過程產(chǎn)生不利影響。評價畜禽肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一為胴體皮下和肌內(nèi)脂肪的含量。由于皮下脂肪較胴體肌內(nèi)脂肪更易沉積，其結(jié)果往往會導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪儲備相對缺乏而皮下脂肪過多，這被認(rèn)為是畜禽高品質(zhì)肉質(zhì)生產(chǎn)的主要障礙之一。近年來，科研工作者運用高通量測序技術(shù)不斷研究畜禽脂肪組織中含有的miRNA，并對其作用和影響進(jìn)行探索，證實了miRNA在畜禽的脂肪沉積與代謝、脂肪細(xì)胞的分化、脂肪細(xì)胞的增殖等生理過程中都起關(guān)鍵作用。

1 miRNA簡介

microRNAs（miRNAs）是由長度為20～25個核苷酸組成的一類內(nèi)源性且具有一定調(diào)控作用的非編碼小RNA，成熟的miRNAs是將初級miRNAs轉(zhuǎn)錄物通過特定核酸酶的剪切加工而形成的，其隨后會組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，并通過使目標(biāo)mRNA失去穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。大量研究表明miRNA可參與血管發(fā)生、脂肪分解與沉積、細(xì)胞增殖分化與凋亡等多個重要的生命過程，故關(guān)于? ?miRNA的研究普遍涉及動植物生長發(fā)育、內(nèi)源激素分泌及疾病發(fā)生等一系列重要的生命活動。

2 miRNA對畜禽脂肪沉積的影響

2.1 miRNA在牛脂肪組織中的相關(guān)研究

Li等[1]在研究miR-21-3p是否可以調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮組織細(xì)胞（BMECs）中甘油三酯產(chǎn)生的試驗中，用生物信息學(xué)方法推測miR-21-3p的靶基因，并發(fā)現(xiàn)BMECs中存在一種可以催化長鏈PUFAs反應(yīng)的限速酶Elovl5，Elovl5是調(diào)控脂質(zhì)代謝的重要基因。經(jīng)生物信息學(xué)及雙熒光素酶報告分析證實Elovl5的3′UTR端中確實存在miR-21-3p靶點。經(jīng)后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miR-21-3p模擬物的BMECs中，甘油三酯含量被上調(diào)。同時，轉(zhuǎn)染miR-21-3p抑制劑的BMECs中甘油三酯含量被下調(diào)，因此推測miR-21-3p通過靶向調(diào)控Elovl5來調(diào)控脂質(zhì)代謝。Zhang等[2]通過比較轉(zhuǎn)錄組分析去勢雄牛與未去勢雄牛在相同情況下肌肉內(nèi)脂肪（IMF）增加情況，發(fā)現(xiàn)IMF增加與miR-224和LPL基因表達(dá)異常有關(guān)，并預(yù)測miR-224可能靶向調(diào)控LPL基因的表達(dá)。用雙熒光素酶報告基因試驗分析轉(zhuǎn)染了miR-224和LPL的293T細(xì)胞，證明了miR-224與LPL之間確實存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系，且在LPL的3′UTR區(qū)域內(nèi)有兩個miR-224的結(jié)合位點，得出miR-224可通過靶向調(diào)控LPL基因來影響牛前脂肪細(xì)胞的成脂分化。此前，miR-454被廣泛報道可參與細(xì)胞增殖、凋亡和癌癥的發(fā)生發(fā)展，而Zhang等[3]通過一系列試驗證實了miR-454可以與奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）中的PPAR-γ（脂肪細(xì)胞形成的主要調(diào)節(jié)器）的3′UTR靶位點特異性結(jié)合，過表達(dá)的miRNA-454會使PPAR-γ的表達(dá)下調(diào)，會降低脂滴的積累和甘油三酯的產(chǎn)生，即miR-454負(fù)向調(diào)控牛乳腺上皮細(xì)胞PPAR-γ基因的表達(dá)來進(jìn)一步調(diào)控脂肪細(xì)胞的生成。Ma等[4]發(fā)現(xiàn)bta-miR-130a和bta-miR-130b可以與其靶基因PPARG和CYP2U1的3′UTR端結(jié)合。bta-miR-130a/b被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子，它的表達(dá)會抑制脂肪調(diào)控基因PPARG的表達(dá)，而促進(jìn)CYP2U1的表達(dá)，從而對肉牛脂肪細(xì)胞的增殖分化起調(diào)控作用。邵靜等[5]以延邊黃牛為研究對象，對閹牛和公牛背最長肌組織中存在表達(dá)差異的基因和miRNA進(jìn)行分析，并經(jīng)qRT-PCR技術(shù)驗證，得出miR-27可以通過調(diào)控ABAT、ATP6V0D2等基因來參與肌肉組織中糖、脂肪、蛋白質(zhì)和能量等物質(zhì)代謝途徑來調(diào)控脂肪代謝。除此之外， miR-27也被證實可以與奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）靶向結(jié)合，從而對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中脂肪的合成起潛在調(diào)控作用[6]。Wang等[7]基于EST（表達(dá)序列標(biāo)記）和GSS（基因組調(diào)查序列）以及牛保守miRNA的聯(lián)合檢測方法，發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-145、miR-2325c 和 miR-2361在牛肌肉和皮下脂肪中有較高的表達(dá)，且4種miRNA在肌肉和皮下脂肪中的差異表達(dá)主要通過MAPK信號通路、WNT信號通路和TGF信號通路3種途徑來發(fā)揮作用。Sun等[8]在對不同發(fā)育階段（胎牛、成年牛）的牛背部脂肪中存在表達(dá)差異的miRNA進(jìn)行試驗分析時，發(fā)現(xiàn)bta-miRNAn25 和 bta-miRNAn26在牛背部脂肪組織中有明顯的表達(dá)差異，表明它們可能會在牛的脂肪組織生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，并且推測其可能是遺傳學(xué)和育種的潛在分子標(biāo)記物。

2.2 miRNA在羊脂肪組織中的相關(guān)研究

Zhou 等[9]對比了綿羊肌肉組織中共815個miRNAs，其中539個miRNAs在哈薩克斯坦綿羊（KS）和西藏綿羊（TS）脂肪組織中均有表達(dá)，并且有179和97個miRNAs在KS和TS中是特異表達(dá)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p是ESRRα的靶向調(diào)控序列，而ESRRα可以抑制前脂肪細(xì)胞的分化。Pan等[10]通過對羊皮下脂肪組織塊進(jìn)行試驗，得出miR-124-3p可以靶向結(jié)合C/EBPα mRNA的3′UTR的3個蛋白位點，直接抑制綿羊位于脂肪組織中具有脂肪生成能力基質(zhì)血管部分（SVFs）的脂肪分化。Byrne等[11]通過對印記基因簇PEG11的研究發(fā)現(xiàn)，其可以編碼miR-431、miR-433、miR-136、miR-127和miR-432，且PEG11過表達(dá)會導(dǎo)致肌肉肥大，如果使miR-433和miR-431的表達(dá)同時上調(diào)，便會抑制脂肪的生成。Zhao等[12]從3日齡山羊頸皮下脂肪組織中分離出其前脂肪細(xì)胞進(jìn)行試驗分析，得出miR-183可直接靶向Smad4的3′UTR，通過抑制Smad4而正向調(diào)控山羊脂肪細(xì)胞的脂肪生成，而Smad4的抑制表達(dá)顯著促進(jìn)了山羊前脂肪細(xì)胞的分化。Ma等[13]發(fā)現(xiàn)miR-25的表達(dá)與泌乳量呈負(fù)相關(guān)，并確定miR-25可以與脂質(zhì)生成的關(guān)鍵調(diào)控因子——過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1（PGC-1beta）3′UTR的3個特定位點靶向結(jié)合，而過表達(dá)的miR-25可導(dǎo)致PGC-1beta的表達(dá)受到抑制，進(jìn)一步抑制某些脂肪基因的表達(dá)和甘油三酯的形成以及脂滴的積累。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)miR-30e-5p和miR-15a在山羊乳腺上皮細(xì)胞（GMEC）中具有特異性表達(dá)。miR-30e-5p與miR-15a均可靶向結(jié)合LRP6，共同抑制LRP6的表達(dá)，促進(jìn)GMEC中的脂肪代謝，并得出結(jié)論，miR-30e-5p和miR-15a通過影響LRP6和YAP1表達(dá)的途徑而協(xié)同調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞的脂肪酸代謝。Wang等[15]證明了miR-145可以直接靶向調(diào)控存在于山羊乳腺上皮細(xì)胞（GMEC）中的脂質(zhì)相關(guān)基因啟動子INSIG1，這是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜（多面體）蛋白質(zhì)，通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保留SREBFs并阻止其在高爾基體中的蛋白質(zhì)水解激活來調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成FA的過程，進(jìn)而有效調(diào)控脂肪生成基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控GMEC中脂肪酸的合成和脂肪的沉積。

2.3 miRNA在豬脂肪組織中的相關(guān)研究

眾所周知，低睪酮水平會導(dǎo)致人類和動物的男性肥胖，即閹割會顯著地導(dǎo)致胴體脂肪的積累，這便是商業(yè)豬肉一般是采用閹割公豬的原因之一。Wang等[16]通過試驗解釋了此現(xiàn)象。通過對比去勢公豬與未去勢公豬的特點，發(fā)現(xiàn)在去勢豬的背部脂肪中MARK4蛋白質(zhì)水平高于未去勢豬，且去勢公豬ssc-miR-7134-3p水平明顯低于未去勢公豬。進(jìn)一步試驗發(fā)現(xiàn)ssc-miR-7134-3p可以靶向結(jié)合MARK4編碼序列（CDS）區(qū)域中的兩個特異位點，從而對MARK4的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用，而MARK4可能通過抑制p38MAPK磷酸化而促進(jìn)去勢公豬的脂肪積累。Li等[17]通過對藏豬與大白豬肝臟的miRNA表達(dá)序列差異進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)共有6個存在表達(dá)差異的miRNA（miR-34a、miR-326、miR-1、miR-335、miR-185和miR-378），且其均可參與糖、脂質(zhì)代謝。在西藏豬的肝臟中，低水平的miR-34a可能通過增加Sirtuin 1（Sirt1）型的表達(dá)而促進(jìn)糖異生;低表達(dá)水平的miR-1可增加肝臟X受體α（LXRα）的表達(dá)，從而促進(jìn)脂質(zhì)的合成和積累;miR-185可以通過增加B類Ⅰ型“清道夫”受體（SR-BI）的表達(dá)，而促進(jìn)血液中膽固醇的吸收和膽汁的分泌從而進(jìn)一步影響脂肪沉積。Taniguchi等[18]通過用miR-33b轉(zhuǎn)染豬皮下脂肪前細(xì)胞（PSPA）觀察到脂肪分化延遲和脂肪積累減少的現(xiàn)象，即miR-33b可通過EBF1-C/EBPα和PPARγ通路而抑制脂肪合成基因的表達(dá)， 影響皮下前脂肪細(xì)胞（PSPA）的分化和發(fā)育，進(jìn)而推遲脂肪分化并降低脂質(zhì)沉積速度。Mentzel等[19]發(fā)現(xiàn)肥胖豬皮下脂肪組織中的miR-9和miR-124表達(dá)量高于普通水平且有顯著上調(diào)現(xiàn)象，推測miR-9和miR-124與脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的沉積有關(guān)。Liu等[20]通過對原代豬前體細(xì)胞試驗，發(fā)現(xiàn)miR-375可以對豬前脂肪細(xì)胞內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)受體（BMPR2）進(jìn)行靶向調(diào)控，且沉默的BMPR2與過度表達(dá)的miR-375在脂肪的分化方面具有相同的抑制作用。其證明了miR-375是豬原代前體脂肪分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，并可對豬脂肪的分化產(chǎn)生影響。Ji等[21]在Solexa測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)miR-125a在成年豬背膘中表達(dá)較高。并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-125 a可以大大抑制脂肪生成標(biāo)記物PPARγ、LPL、aP2基因的mRNA表達(dá)，并且還會通過影響目標(biāo)基因ERRα的表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)積累顯著減少。從而得出結(jié)論，ERRα可以在miR-125a的靶向調(diào)控下抑制豬前脂肪細(xì)胞的分化。Du等[22]發(fā)現(xiàn)在豬肌肉前脂肪細(xì)胞中存在兩個miR-125a-5p的靶基因。在脂肪細(xì)胞分化過程中，miR-125a-5p可與靶基因克虜伯類因子3（KLF13）的靶位點特異性結(jié)合，影響細(xì)胞分化;在豬肌肉內(nèi)脂肪發(fā)生過程中可與特異性脂肪酸組成的調(diào)節(jié)因子脂肪酸延長酶6（ELOVL6）結(jié)合，調(diào)控脂肪生成。結(jié)果表明miR-125a-5p可能是一種新型的調(diào)控豬肌肉內(nèi)脂肪生成和豬IMF脂肪酸組成的調(diào)控因子，且與豬肌內(nèi)脂肪沉積呈負(fù)相關(guān)。Liu等[23]使用miRNA測序（miRNA-seq）技術(shù)分析了約克郡豬（YY，瘦肉型）和中國皖南花豬（WH，脂肪型）的背最長肌中的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-196a/b（miR-196a，miR-196b-5p）的表達(dá)差異明顯，且其在WH中表達(dá)量最高，故推測miR -196a/b可能通過刺激脂肪細(xì)胞因子信號通路，促進(jìn)豬背最長肌組織的脂肪生成。

2.4 miRNA在禽類脂肪組織中的相關(guān)研究

邵芳等[24]利用生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出了與脂質(zhì)代謝有關(guān)且其3′端的2～8位可與miR-33完全互補(bǔ)的候選靶基因CHPT1，將miR-33過表達(dá)載體和CHPT1熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染到小鼠的成肌細(xì)胞系C2C12中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)如果miR-33與CHPT1的預(yù)測靶位點結(jié)合，則CHPT1基因的表達(dá)便會受到抑制，即得出miR-33可以通過對CHPT1基因的負(fù)調(diào)節(jié)作用來調(diào)節(jié)禽類脂質(zhì)代謝。Liu等[25]發(fā)現(xiàn)鵝在短時間內(nèi)過量攝入食物會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝脂肪變性，通過進(jìn)一步試驗發(fā)現(xiàn)，在肝臟、脂肪和肌肉中miR-29c的表達(dá)被全面抑制，為了驗證miR-29c的功能是否與鵝肝組織變性有關(guān)，預(yù)測了3個靶基因（即參與能量穩(wěn)態(tài)或細(xì)胞生長的Insig1、Sgk1和Col3a1）通過雙熒光報告系統(tǒng)等體外試驗對其進(jìn)行驗證，最后得出miR-29c可能通過其靶基因調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)和組織生長，促進(jìn)鵝對嚴(yán)重肝脂肪變性的耐受，從而對脂肪的代謝與沉積產(chǎn)生影響。Zhang 等[26]在對雞進(jìn)行與其肉質(zhì)相關(guān)的miRNA分析試驗中，測量雞兩個不同生理階段的肌肉內(nèi)脂肪（IMF）含量，整合分析miRNA-Seq和RNA-Seq數(shù)據(jù)，并建立雞肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化模型。通過熒光素酶報告分析、miRNA過表達(dá)和油紅O染色試驗明確gga-miR-140-5p在肌內(nèi)脂肪的靶點，且證明了gga-miR-140-5p能夠利用靶向類視黃醇X受體γ而促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。Fu等[27]對不同日齡的固始雞乳腺肌肉組織中存在顯著表達(dá)差異的miRNAs進(jìn)行KEGG通路分析以顯示代謝途徑，并構(gòu)建與乳腺肌肉發(fā)育和IMF沉積有關(guān)的miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，最終發(fā)現(xiàn)gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p可能對雞肌內(nèi)脂肪的沉積起關(guān)鍵作用。

3 miRNA在畜禽遺傳育種方面的應(yīng)用

畜禽的育種不僅可以根據(jù)其表觀性狀進(jìn)行選育，其體內(nèi)具有調(diào)控作用的基因更應(yīng)該作為重要的參考。基因種類及表達(dá)水平的不同決定了性狀的不同。目前，已確定功能存在于畜禽的miRNA較多，這為畜禽的繁殖育種提供了重要的參考并奠定理論基礎(chǔ)。充分了解畜禽各組織器官中基因信號通路及生物學(xué)過程的調(diào)控機(jī)制，有助于了解畜禽性狀特點及規(guī)律。試驗證明多數(shù)miRNAs對畜禽的不同部位（如乳腺的上皮組織、肌內(nèi)脂肪組織、皮下脂肪組織等）的脂肪代謝與沉積都有一定的調(diào)控作用。例如存在于奶牛的乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）中的miR-21-3p、miR-454和miRNA-27;存在于羊乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）中miR-30e-5p、miR-15a和miR-145都對乳腺中脂肪的代謝與沉積有不同的調(diào)控作用;存在于牛肌內(nèi)脂肪的miR-224，存在于皮下脂肪的miR-143、miR-145、bta-miRNAn25和bta-miRNAn26等;存在于豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的miR-125a-5p，和脂肪細(xì)胞中促進(jìn)分化的miR-33b、miR‐375、miR-125a-5p等;調(diào)節(jié)禽類脂肪代謝的miR-33、gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p等，這些存在于畜禽脂肪中的miRNAs對于畜禽自身而言可以不同程度地調(diào)控其脂肪的分化與沉積，同時這些miRNAs也可以作為標(biāo)記輔助因子，對優(yōu)質(zhì)畜禽品種的選育及畜禽品種改良優(yōu)化都發(fā)揮重要的參考和指導(dǎo)作用。進(jìn)一步了解這些特性miRNA背后的分子機(jī)制，將為優(yōu)化牛羊的乳質(zhì)和畜禽的肉品質(zhì)提供重要的思路，還有助于改善其泌乳性能并優(yōu)化其產(chǎn)肉性能。從整體來看，畜禽的miRNA研究為畜禽的遺傳選育提供了重要參考。

4 小結(jié)

關(guān)于機(jī)體組織miRNA種類和功能的檢測主要包括機(jī)體細(xì)胞的分離、體外細(xì)胞培養(yǎng)與分化、靶基因的預(yù)測、雙熒光素酶報告分析、油紅O染色、靶基因的轉(zhuǎn)染驗證試驗、實時定量熒光PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡分析及統(tǒng)計分析等基本步驟。由于miRNA功能的重要性及其檢測方法的普及性，目前，有關(guān)miRNA種類和性能的研究非常廣泛，機(jī)體組織中被證實功能的miRNA也層出不窮，不僅涉及植物病癥研究和性狀調(diào)控，也涉及動物研究，包括疾病原因的探討，機(jī)體皮毛、器官、肌肉、脂肪等生長的調(diào)控機(jī)制，產(chǎn)奶產(chǎn)蛋性能的調(diào)控，遺傳繁殖質(zhì)量及數(shù)量的調(diào)控等。具有不同調(diào)控作用的miRNAs不僅可以作為動物體質(zhì)評定及性能評定的有效依據(jù)，同時在育種工作方面也有重要指導(dǎo)作用。由于在不同種動物或同種動物的不同年齡階段以及同年齡階段但具有不同形態(tài)特征的同種動物，其機(jī)體內(nèi)的miRNA種類或同種miRNA的表達(dá)都存在一定的差異，故miRNA的未知領(lǐng)域仍很寬廣，需科研工作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與驗證。

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